Composizione di misurazione del complesso di segnalazione che induce la morte CD95 ed elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso
Summary
Qui viene presentato un flusso di lavoro sperimentale che consente il rilevamento dell’elaborazione della caspasi-8 direttamente nel complesso di segnalazione che induce la morte (DISC) e determina la composizione di questo complesso. Questa metodologia ha ampie applicazioni, dallo svelamento dei meccanismi molecolari delle vie di morte cellulare alla modellazione dinamica delle reti di apoptosi.
Abstract
L’apoptosi estrinseca è mediata dall’attivazione dei recettori di morte (DR) come CD95/Fas/APO-1 o il recettore 1/recettore 2 del ligando che induce l’apoptosi correlata al fattore di necrosi tumorale (TRAIL)-recettore 2 (TRAIL-R1/R2). La stimolazione di questi recettori con i loro ligandi affini porta all’assemblaggio del complesso di segnalazione che induce la morte (DISC). DISC comprende DR, la proteina adattatrice Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspasi-8/-10 e proteine enzima-inibitorie cellulari FADD-like (IL)-1β-converting enzyme-inibitory proteins (c-FLIP). Il DISC funge da piattaforma per l’elaborazione e l’attivazione della procaspasi-8. Quest’ultimo avviene attraverso la sua dimerizzazione / oligomerizzazione nei filamenti del dominio effettrice della morte (DED) assemblati al DISC.
L’attivazione della procaspasi-8 è seguita dalla sua elaborazione, che avviene in più passaggi. In questo lavoro, viene descritto un flusso di lavoro sperimentale stabilito che consente la misurazione della formazione di DISC e l’elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso. Il flusso di lavoro si basa su tecniche di immunoprecipitazione supportate dall’analisi western blot. Questo flusso di lavoro consente un attento monitoraggio delle diverse fasi del reclutamento della procaspasi-8 al DISC e alla sua elaborazione ed è molto rilevante per lo studio dei meccanismi molecolari dell’apoptosi estrinseca.
Introduction
Uno dei recettori di morte (DR) meglio studiati è CD95 (Fas, APO-1). La via apoptotica estrinseca inizia con l’interazione del DR con il suo ligando affine, cioè CD95L interagisce con CD95 o TRAIL si lega a TRAIL-R. Ciò si traduce nella formazione del DISCO al corrispondente DR. DISC costituito da CD95, FADD, procaspasi-8/-10 e proteine c-FLIP1,2. Inoltre, il DISC è assemblato per interazioni tra proteine contenenti dominio di morte (DD), come CD95 e FADD, e proteine contenenti DED come FADD, procaspasi-8/-10 e c-FLIP (Figura 1). La procaspasi-8 subisce l’oligomerizzazione tramite associazione dei suoi DED, con conseguente formazione di filamenti DED, seguita dall’attivazione e dall’elaborazione della procaspasi-8. Questo innesca una cascata di caspasi, che porta alla morte cellulare (Figura 1)3,4. Pertanto, la procaspasi-8 è una caspasi iniziatrice centrale della via estrinseca dell’apoptosi estrinseca mediata da CD95 o TRAIL-R, attivata alla corrispondente piattaforma macromolecolare, DISC.
Due isoforme di procaspasi-8, vale a dire procaspasi-8a (p55) e -8b (p53), sono note per essere reclutate nel DISC5. Entrambe le isoforme comprendono due DED. DED1 e DED2 si trovano nella parte N-terminale della procaspasi-8a/b seguita dai domini catalitici p18 e p10. L’analisi dettagliata al microscopio crioelettronico (cryo-EM) dei DED della procaspasi-8 ha rivelato l’assemblaggio delle proteine della procaspasi-8 in strutture filamentose chiamate filamenti DED4,6. Sorprendentemente, le catene lineari di procaspasi-8 sono state inizialmente suggerite per essere impegnate nella dimerizzazione seguita dall’attivazione della procaspasi-8 al DISC. Ora, è noto che quelle catene sono solo una sottostruttura del filamento DED procaspasi-8, quest’ultimo composto da tre catene assemblate in una tripla elica3,4,6,7.
Dopo la dimerizzazione al filamento DED, i cambiamenti conformazionali nella procaspasi-8a / b portano alla formazione del centro attivo della procaspasi-8 e alla sua attivazione3,8. Segue la lavorazione della procaspasi-8, che è mediata da due percorsi: il primo passa attraverso la generazione di un prodotto di scissione p43/p41 e il secondo attraverso la generazione iniziale di un prodotto di scissione p30. La via p43/p41 è iniziata dalla scissione della procaspasi-8a/b ad Asp374, con conseguente scissione di p43/p41 e p12 (Figura 2). Inoltre, questi frammenti sono autocatalizzati in asp384 e Asp210/216, dando origine alla formazione dell’eterotetramero attivo caspasi-8, p102/p1829,10,11. Inoltre, è stato dimostrato che in parallelo alla via di lavorazione p43/p41, la procaspasi-8a/b viene scissa anche ad Asp216, il che porta alla formazione del prodotto di scissione C-terminale p30, seguito dalla sua proteolisi a p10 e p1810 (Figura 2).
L’attivazione della procaspasi-8a/b al filamento DED è strettamente regolata da proteine denominate c-FLIP12. Le proteine c-FLIP si trovano in tre isoforme: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS)e c-FLIPRaji (c-FLIPR). Tutte e tre le isoforme contengono dueD nella loro regione N-terminale. c-FLIPL ha anche un dominio C-terminale cataliticamente inattivo simile alla caspasi12,13. Entrambe le isoforme corte di c-FLIP-c-FLIPS e c-FLIPR-agiscono in modo anti-apoptotico interrompendo la formazione di filamenti DED al DISCO6,14,15. Inoltre, c-FLIPL può regolare l’attivazione della caspasi-8 in modo dipendente dalla concentrazione. Ciò può comportare effetti sia pro- che anti-apoptotici16,17,18. Formando l’eterodimero cataliticamente attivo procaspasi-8/c-FLIPL, c-FLIPL porta alla stabilizzazione del centro attivo della procaspasi-8 e alla sua attivazione. La funzione pro- o anti-apoptotica di c-FLIPL dipende direttamente dalla sua quantità ai filamenti DED e dalla successiva quantità di eterodimeri assemblati di procaspasi-8/c-FLIPL 19. Concentrazioni basse o intermedie di c-FLIPL al DISC provocano quantità sufficienti di eterodimeri procaspasi-8/c-FLIPL al filamento DED, che supporta l’attivazione della caspasi-8. Al contrario, l’aumento delle quantità di c-FLIPL porta direttamente ai suoi effetti anti-apoptotici al DISC20.
Nel complesso, l’attivazione e l’elaborazione della procaspasi-8a/b al DISC è un processo altamente regolamentato che coinvolge diverse fasi. Questo documento discute la misurazione dell’elaborazione della procaspasi-8 direttamente sul DISC e l’analisi della composizione di questo complesso. Questo sarà presentato utilizzando CD95 DISC come complesso DR esemplare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo approccio è stato descritto per la prima volta da Kischkel et al.27 e da allora è stato sviluppato con successo da diversi gruppi. Diverse questioni importanti devono essere considerate per un’efficiente elaborazione disc-immunoprecipitazione e monitoraggio della caspasi-8 in questo complesso.
In primo luogo, è essenziale seguire tutte le fasi di lavaggio durante l’immunoprecipitazione. Particolarmente importanti sono le fasi finali di lavaggio delle perle di …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), il Center of Dynamic Systems (CDS), finanziato dal programma UE FESR (Fondo europeo di sviluppo regionale) e dal DFG (LA 2386) per sostenere il nostro lavoro. Ringraziamo Karina Guttek per aver supportato i nostri esperimenti. Riconosciamo il Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburgo) per averci fornito cellule T primarie.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
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