Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия внеклеточных везикул в трех измерениях
Summary
Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM) используется для обхода типичного дифракционного предела световой микроскопии и для просмотра экзосом в нанометровом масштабе. Он может быть использован как в двух, так и в трех измерениях для характеристики экзосом.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EV) высвобождаются всеми типами клеток и играют важную роль в клеточной сигнализации и гомеостазе. Визуализация электромобилей часто требует косвенных методов из-за их малого диаметра (40-250 нм), который ниже дифракционного предела типичной световой микроскопии. Мы разработали визуализацию электромобилей на основе микроскопии сверхвысокого разрешения, чтобы обойти дифракционный предел как в двух, так и в трех измерениях. Используя этот подход, мы можем разрешить трехмерную форму электромобилей с разрешением +/- 20 нм по оси XY и разрешением +/- 50 нм по оси Z. В заключение мы предлагаем рассматривать микроскопию сверхвысокого разрешения как метод характеристики EV, включая экзосомы, а также вирусы в оболочке.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой мембранно-связанные везикулы, высвобождаемые всеми типами клеток. Они содержат липиды, белки, метаболиты и нуклеиновые кислоты и переносят эти материалы локально между клетками и дистально между тканями и органами. Существует три основных подтипа EV: апоптотические тела, микровезикулы и экзосомы1,2. Здесь мы сосредоточим наше обсуждение на экзосомах и связанных с ними белках.
Экзосомы представляют собой секретируемые везикулы, возникающие из внутреннего бутонизации ранних эндосом в мультивезикулярное тело (MVB). Затем MVB сливается с плазматической мембраной, высвобождая экзосомы во внеклеточное пространство для перемещения в другие клетки3,4. Экзосомы существуют в спектре размеров от 40 до 150 нм и обогащены эндосомальными трансмембранными белками, известными как тетраспанины (CD9, CD63, CD81), мембранно-связанным эндосомальным сортировочным комплексом, необходимым для транспорта (ESCRT), и липидными рафт-ассоциированными белками1,2,5,6,7.
Характеристика биохимического состава экзосом стала популярной областью для исследователей, чтобы лучше понять их функциональную природу. Существует множество методов визуализации и характеристики экзосом, включая наноразмерную проточную цитометрию, анализ отслеживания наночастиц (NTA), сканирующую и просвечивающую электронную микроскопию (TEM), поверхностный плазмонный резонанс, резистивное импульсное зондирование и традиционную световую микроскопию, каждая из которых содержит внутренние плюсы и минусы8,9. ТЭМ и крио-ЭМ могут достигать нанометрового разрешения, но часто требуют этапов обезвоживания и замораживания-разрушения, тем самым уменьшая или лизуя EV10,11. NTA полагается на рассеяние света, позволяя характеризовать сотни EV одновременно, но является косвенным измерением размера частиц и не может легко различить EV, вирусы и белковые агрегаты12,13,14,15,16. Наноразмерная проточная цитометрия использует рассеяние света от пути возбуждения, которое затем может быть преобразовано в измерения размера, но является новой технологией, и существует мало консенсуса относительно того, какой размер частиц находится в линейном диапазоне обнаружения для различных инструментов12,17,18.
Традиционная световая микроскопия с использованием флуоресцентных белков или красителей была одним из наиболее широко используемых методов визуализации субклеточных компартментов, белковых комплексов и сигнальных механизмов внутри клетки. Хотя этот метод оказывается полезным при визуализации локализации комплексов, дифракционный предел традиционной световой микроскопии (около 250-400 нм) препятствует четкому разрешению белков или структур в типичном диапазоне размеров экзосомы (40-150 нм)12,19,20.
Микроскопия сверхвысокого разрешения, а именно прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM), отличается от обычной световой микроскопии тем, что использует фотопереключаемые свойства конкретных флуорофоров и обнаруживает эти мигающие события для реконструкции изображений до нанометровой точности21. События переключения фотографий собираются с помощью камеры обнаружения с высокой частотой кадров в течение десятков тысяч индивидуальных экспозиций, а функция точечного распространения используется для отображения с высокой степенью достоверности точного местоположения фотопереключающего флуорофора19,20,22. Это позволяет dSTORM обходить дифракционный предел световой микроскопии. Несколько групп сообщили об использовании методов сверхвысокого разрешения для визуализации и отслеживания экзосом и связанных с ними белков22,23,24,25. Конечное разрешение зависит от биофизических свойств флуорофора, но часто колеблется от +/-10-100 нм вдоль оси XY, что позволяет использовать одномолекулярное разрешение.
Способность разрешать отдельные флуорофоры в этом масштабе на оси XY произвела революцию в микроскопии. Тем не менее, существует мало данных о трехмерном (3-D) dSTORM экзосомы. Поэтому мы стремились установить стандартную операционную процедуру (SOP) для визуализации и характеристики очищенных электромобилей на основе dSTORM, включая экзосомы с нанометровой точностью в 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Электромобили стали популярной областью исследований из-за их важной роли во многих внутриклеточных процессах и межклеточной передаче сигналов1,30. Однако их визуализация оказывается сложной, поскольку их небольшой размер падает ниже дифракционного пр?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Oxford Nanoimaging за их конструктивную обратную связь и руководство. Эта работа финансировалась 5UM1CA121947-10 для R.P.M. и 1R01DA040394 для D.P.D.
Materials
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
References
- Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
- Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
- Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis – An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
- Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
- Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
- Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
- Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
- Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
- Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
- Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
- Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
- Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
- Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
- McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
- Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
- Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
- Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
- Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
- Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
- Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
- Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
- Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
- Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
- Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
- Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
- Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
- Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
- Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).
