Bereiding van multifunctionele op zijde gebaseerde microcapsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor RNA-aptameren en riboswitches
Summary
Het protocol beschrijft de vorming van robuuste en biocompatibele DNA-beladen microcapsules als gemultiplexte in vitro biosensoren die verschillende liganden kunnen volgen.
Abstract
We introduceren een protocol voor de bereiding van met DNA beladen zijdefibroïnemicrocapsules via de Layer-by-Layer (LbL) assemblagemethode op offerende bolvormige kernen. Na adsorptie van een eerste laag en DNA-plasmiden werd de vorming van robuuste microcapsules vergemakkelijkt door β-vellen in de secundaire zijdestructuur te induceren tijdens acute uitdroging van een enkele zijdelaag. Vandaar dat de gelaagdheid plaatsvond via meerdere waterstofbindingen en hydrofobe interacties. Na adsorptie van meerlaagse schillen kunnen de kernschilstructuren verder worden gefunctionaliseerd met gouden nanodeeltjes (AuNP’s) en/of antilichamen (IgG) om te worden gebruikt voor teledetectie en/of gerichte toediening. Het aanpassen van verschillende belangrijke parameters tijdens sequentiële depositie van belangrijke macromoleculen op silicakernen, zoals de aanwezigheid van een polymeerprimer, de concentratie van DNA en zijde-eiwit, evenals een aantal geadsorbeerde lagen, resulteerde in biocompatibele, DNA-beladen microcapsules met variabele permeabiliteit en DNA-belastingen. Bij het oplossen van silicakernen toonde het protocol de vorming aan van holle en robuuste microcapsules met DNA-plasmiden geïmmobiliseerd op het binnenoppervlak van het capsulemembraan. Het creëren van een selectief doorlaatbaar biocompatibel membraan tussen de DNA-plasmiden en de externe omgeving bewaarde het DNA tijdens langdurige opslag en speelde een belangrijke rol in de verbeterde outputrespons van ruimtelijk beperkte plasmiden. De activiteit van DNA-sjablonen en hun toegankelijkheid werden getest tijdens in vitro transcriptie- en translatiereacties (celvrije systemen). DNA-plasmiden die coderen voor RNA-oplichtende aptameren en riboswitches werden met succes geactiveerd met overeenkomstige analyten, zoals werd gevisualiseerd tijdens de lokalisatie van fluorescerend gelabelde RNA-transcripten of GFPa1-eiwit in de schaalmembranen.
Introduction
Het gebied van synthetische biologie biedt unieke mogelijkheden om detectiemogelijkheden te ontwikkelen door gebruik te maken van natuurlijke mechanismen die door micro-organismen zijn ontwikkeld om hun omgeving en potentiële bedreigingen te monitoren. Belangrijk is dat deze detectiemechanismen meestal gekoppeld zijn aan een reactie die deze micro-organismen beschermt tegen schadelijke blootstelling, genexpressie reguleert om negatieve effecten te verminderen of inname van giftige materialen te voorkomen. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om deze micro-organismen te ontwikkelen om sensoren met hele cellen te maken die profiteren van deze natuurlijke reacties, maar ze opnieuw richten om nieuwe doelen te herkennen en / of een meetbaar signaal te produceren dat kan worden gemeten voor kwantificeringsdoeleinden (meestal fluorescentie)1,2. Momenteel wijzen zorgen over het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen (GGO’s), met name bij introductie in het milieu of het menselijk lichaam, als gevolg van lekkage van hele cellen of een deel van hun genetisch materiaal, zelfs als het is ingekapseld in een polymeermatrix, erop dat alternatieve manieren nodig zijn om deze detectiebenaderingen te benutten3.
Een krachtige aanpak om de voordelen van op micro-organismen gebaseerde detectie te benutten zonder de zorg voor de inzet van GGO’s is het gebruik van in vitro transcriptie/translatie (IVTT) systemen. Vanuit een praktisch perspectief bestaan IVTT-systemen uit een mengsel dat de meeste celcomponenten in een actieve toestand bevat en dat op verschillende manieren uit cellen is “geëxtraheerd”, waaronder ultrasoonapparaat, kralenkloppen of andere4. Het eindproduct van dit proces is een biochemisch reactiemengsel dat al is geoptimaliseerd om transcriptie en translatie uit te voeren en dat kan worden gebruikt om verschillende sensoren in een “open vat” -formaat te testen, zonder de beperkingen die gepaard gaan met het gebruik van hele cellen (membraandiffusie, transformatie-efficiëntie, celtoxiciteit, enz.). Belangrijk is dat verschillende sensorcomponenten kwantitatief kunnen worden toegevoegd en hun effect kan worden bestudeerd door verschillende optische en spectrometrische technieken, zoals we hebben aangetoond5. Het is opgevallen dat de prestaties van IVTT-systemen inconsistent kunnen zijn; Recente studies hebben echter benaderingen aangetoond om hun voorbereiding en karakterisering te standaardiseren, wat van grote hulp is bij het bestuderen van hun prestaties in sensorontwerp6. Onlangs zijn veel voorbeelden van IVTT-systemen die worden gebruikt om op papier gebaseerde assays te maken door de lyofilisatie van hun componenten in papieren matrices gedemonstreerd, waaronder detectie van zware metaalionen, geneesmiddelen, quorumdetectie-elementen en andere 7,8,9. Een opwindende toepassingsruimte voor IVTT-gebaseerde sensoren is hun gebruik in detectietoepassingen in verschillende soorten omgevingen, waaronder bodem, water en het menselijk lichaam. Om deze IVTT-systemen in deze uitdagende omgevingen te implementeren, moet een inkapselingsbenadering worden geïmplementeerd om de IVTT-componenten te bevatten en te beschermen tegen degradatie.
De meest voorkomende inkapselingsbenaderingen voor IVTT-systemen omvatten het gebruik van lipidecapsules, micellen, polymersomen en andere nauw gesloten microcontainers10,11,12. Een nadeel van deze aanpak is de noodzaak om passieve of actieve mechanismen in te bouwen om materialen in en uit de containers te transporteren om communicatie met de externe omgeving mogelijk te maken en detectiemogelijkheden te bieden. Om enkele van deze problemen op te lossen, rapporteert de studie hier een methode die een eenvoudige maar effectieve aanpak biedt om de coderingsmaterialen voor verschillende sensorontwerpen in te kapselen die in IVTT-systemen moeten worden uitgedrukt. Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van Layer-by-Layer (LbL) depositie van een biopolymeer in de aanwezigheid van de plasmiden van belang om holle microcapsules met hoge porositeit te creëren, waardoor het beschermde genetische materiaal kan interageren met de verschillende componenten van de IVTT van keuze. De studie toonde aan dat ingekapselde plasmiden transcriptie en translatie konden sturen wanneer ze binnen deze polymere matrix werden geactiveerd, zoals blijkt uit de respons van een plasmide-gecodeerde aptamer en een riboswitch op hun overeenkomstige doelen. Bovendien beschermt deze LbL-coating de plasmiden maandenlang zonder speciale bewaarcondities.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selectief doorlatende hydrogel-microcapsules geladen met verschillende soorten DNA-gecodeerde sensorontwerpen kunnen volgens dit protocol worden bereid. Een van de onderscheidende kenmerken van de LbL-benadering is het vermogen om de complexiteit van microcapsules aan te passen tijdens de bottom-up assemblage, die meestal begint met de adsorptie van moleculaire soorten op offersjablonen. Door de concentraties van de initiële componenten, pH-omstandigheden en het aantal lagen zorgvuldig aan te passen, kunnen microcapsule…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door LRIR 16RH3003J-subsidie van het Air Force Office of Scientific Research, evenals het Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S &T Priorities (ARAP) -programma van het Amerikaanse kantoor van de onderminister van Defensie voor Onderzoek en Engineering.
De plasmidevectorsequentie voor ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) werd genereus verstrekt door Dr. J. Gallivan. Zijderupsen cocons van Bombyx mori werden genereus gedoneerd door Dr. D.L. Kaplan van Tufts University, MA.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
