Herstellung von multifunktionalen Mikrokapseln auf Seidenbasis, die mit DNA-Plasmiden beladen sind, die für RNA, Aptamere und Riboschalter kodieren
Summary
Das Protokoll beschreibt die Bildung robuster und biokompatibler DNA-beladener Mikrokapseln als gemultiplexte In-vitro-Biosensoren , die in der Lage sind, mehrere Liganden zu verfolgen.
Abstract
Wir stellen ein Protokoll für die Herstellung von DNA-beladenen Seidenfibroin-Mikrokapseln über die Layer-by-Layer (LbL) Assemblierungsmethode auf sphärischen Opferkernen vor. Nach Adsorption einer Hauptschicht und DNA-Plasmiden wurde die Bildung robuster Mikrokapseln durch die Induktion von β-Blättern in der Seidensekundärstruktur während der akuten Dehydratisierung einer einzelnen Seidenschicht erleichtert. Daher erfolgte die Schichtung über mehrfache Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen. Nach der Adsorption von mehrschichtigen Hüllen können die Kern-Schale-Strukturen mit Goldnanopartikeln (AuNPs) und/oder Antikörpern (IgG) weiter funktionalisiert werden, um sie für die Fernerkundung und/oder den gezielten Transport zu verwenden. Die Einstellung mehrerer Schlüsselparameter während der sequentiellen Abscheidung von wichtigen Makromolekülen auf Siliziumdioxidkernen, wie z. B. das Vorhandensein eines Polymerprimers, die Konzentration von DNA und Seidenprotein sowie eine Reihe von adsorbierten Schichten, führte zu biokompatiblen, DNA-beladenen Mikrokapseln mit variabler Permeabilität und DNA-Beladung. Nach der Auflösung von Siliziumdioxidkernen zeigte das Protokoll die Bildung von hohlen und robusten Mikrokapseln mit DNA-Plasmiden, die an der Innenfläche der Kapselmembran immobilisiert waren. Durch die Schaffung einer selektiv permeablen biokompatiblen Membran zwischen den DNA-Plasmiden und der äußeren Umgebung blieb die DNA während der Langzeitlagerung erhalten und spielte eine wichtige Rolle bei der verbesserten Output-Antwort von räumlich begrenzten Plasmiden. Die Aktivität von DNA-Templates und ihre Zugänglichkeit wurden während in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen (zellfreie Systeme) getestet. DNA-Plasmide, die für RNA-Light-up-Aptamere und Riboschalter kodieren, wurden erfolgreich mit entsprechenden Analyten aktiviert, wie bei der Lokalisierung von fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripten oder GFPa1-Proteinen in den Schalenmembranen sichtbar wurde.
Introduction
Das Gebiet der synthetischen Biologie bietet einzigartige Möglichkeiten, Sensorfähigkeiten zu entwickeln, indem natürliche Mechanismen genutzt werden, die von Mikroorganismen entwickelt wurden, um ihre Umwelt und potenzielle Bedrohungen zu überwachen. Wichtig ist, dass diese Sensormechanismen in der Regel mit einer Reaktion verbunden sind, die diese Mikroorganismen vor schädlicher Exposition schützt und die Genexpression reguliert, um negative Auswirkungen zu mildern oder die Aufnahme giftiger Materialien zu verhindern. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um diese Mikroorganismen so zu verändern, dass sie Ganzzellsensoren herstellen, die diese natürlichen Reaktionen nutzen, sie aber umleiten, um neue Ziele zu erkennen und/oder ein messbares Signal zu erzeugen, das zu Quantifizierungszwecken gemessen werden kann (typischerweise Fluoreszenz)1,2. Gegenwärtig deuten Bedenken hinsichtlich der Verwendung genetisch veränderter Mikroorganismen (GVO), insbesondere bei der Freisetzung in der Umwelt oder im menschlichen Körper, aufgrund des Austritts ganzer Zellen oder eines Teils ihres genetischen Materials, selbst wenn es in einer Polymermatrix eingekapselt ist, darauf hin, dass alternative Wege zur Nutzung dieser Sensoransätze erforderlich sind3.
Ein wirksamer Ansatz, um die Vorteile der mikroorganismenbasierten Sensorik zu nutzen, ohne sich Gedanken über den Einsatz von GVO machen zu müssen, ist die Verwendung von In-vitro-Transkriptions-/Translationssystemen (IVTT). Aus praktischer Sicht bestehen IVTT-Systeme aus einer Mischung, die die meisten Zellbestandteile in einem aktiven Zustand enthält, die auf unterschiedliche Weise aus den Zellen “extrahiert” wurden,z. B. durch Beschallung, Perlenschlagen oder andere 4. Das Endprodukt dieses Prozesses ist ein biochemisches Reaktionsgemisch, das bereits für die Transkription und Translation optimiert ist und zum Testen verschiedener Sensoren in einem “offenen Gefäß”-Format verwendet werden kann, ohne die Einschränkungen, die mit der Verwendung ganzer Zellen verbunden sind (Membrandiffusion, Transformationseffizienz, Zelltoxizität usw.). Wichtig ist, dass verschiedene Sensorkomponenten quantitativ hinzugefügt und ihre Wirkung durch verschiedene optische und spektrometrische Techniken untersucht werden können, wie wir gezeigt haben5. Es wurde festgestellt, dass die Leistung von IVTT-Systemen inkonsistent sein kann. Neuere Studien haben jedoch Ansätze zur Standardisierung ihrer Präparation und Charakterisierung gezeigt, was bei der Untersuchung ihrer Leistung im Sensordesign eine große Hilfe ist6. In jüngster Zeit wurden viele Beispiele für IVTT-Systeme demonstriert, die zur Herstellung papierbasierter Assays durch die Gefriertrocknung ihrer Komponenten in Papiermatrizes verwendet werden, einschließlich der Detektion von Schwermetallionen, Drogen, Quorum-Sensorelementen und anderen 7,8,9. Ein spannender Anwendungsbereich für IVTT-basierte Sensoren ist ihr Einsatz in Sensoranwendungen in verschiedenen Arten von Umgebungen, einschließlich Boden, Wasser und dem menschlichen Körper. Um diese IVTT-Systeme in diesen anspruchsvollen Umgebungen einsetzen zu können, muss ein Kapselungsansatz implementiert werden, um die IVTT-Komponenten einzudämmen und sie vor Verschlechterung zu schützen.
Die gebräuchlichsten Verkapselungsansätze für IVTT-Systeme umfassen die Verwendung von Lipidkapseln, Mizellen, Polymersomen und anderen dicht geschlossenen Mikrobehältern10,11,12. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist die Notwendigkeit, entweder passive oder aktive Mechanismen für den Transport von Materialien in und aus den Behältern zu integrieren, um die Kommunikation mit der externen Umgebung zu ermöglichen und Sensorfunktionen bereitzustellen. Um einige dieser Probleme zu überwinden, berichtet die Studie hier über eine Methode, die einen einfachen, aber effektiven Ansatz zur Verkapselung der Kodierungsmaterialien für verschiedene Sensordesigns bietet, die in IVTT-Systemen ausgedrückt werden sollen. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung der Layer-by-Layer (LbL)-Abscheidung eines Biopolymers in Gegenwart der interessierenden Plasmide, um hohle Mikrokapseln mit hoher Porosität herzustellen, die es dem geschützten genetischen Material ermöglichen, mit den verschiedenen Komponenten des IVTT der Wahl zu interagieren. Die Studie zeigte, dass verkapselte Plasmide die Transkription und Translation steuern können, wenn sie innerhalb dieser polymeren Matrix aktiviert werden, wie die Reaktion eines Plasmid-kodierten Aptamers und eines Riboschalters auf ihre entsprechenden Ziele zeigt. Zusätzlich schützt diese LbL-Beschichtung die Plasmide monatelang ohne besondere Lagerbedingungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektiv permeable Hydrogel-Mikrokapseln, die mit verschiedenen Arten von DNA-kodierten Sensordesigns beladen sind, können nach diesem Protokoll hergestellt werden. Eine der Besonderheiten des LbL-Ansatzes ist die Fähigkeit, die Komplexität von Mikrokapseln während der Bottom-up-Assemblierung maßzuschneidern, die in der Regel mit der Adsorption molekularer Spezies an Opfervorlagen beginnt. Durch sorgfältige Anpassung der Konzentrationen der Ausgangskomponenten, der pH-Bedingungen und der Anzahl der Schichten könne…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das LRIR 16RH3003J-Stipendium des Air Force Office of Scientific Research sowie durch das Programm Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) des U.S. Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering unterstützt.
Die Plasmidvektorsequenz für ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) wurde großzügigerweise von Dr. J. Gallivan zur Verfügung gestellt. Seidenraupenkokons von Bombyx mori wurden großzügig von Dr. D.L. Kaplan von der Tufts University, MA, gespendet.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
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