RNAアプタマーおよびリボスイッチをコードするDNAプラスミドを装填した多機能シルクベースのマイクロカプセルの調製
Summary
このプロトコルは、堅牢で生体適合性のあるDNAを含むマイクロカプセルの形成を、いくつかのリガンドを追跡できるマルチプレックス 化されたin vitro バイオセンサーとして説明しています。
Abstract
犠牲球状コア上でのLayer-by-layer(LbL)アセンブリ法によるDNA含有絹フィブロインマイクロカプセルの調製のためのプロトコルを紹介します。プライム層とDNAプラスミドの吸着に続いて、単一のシルク層の急性脱水中にシルク二次構造にβシートを誘導することにより、堅牢なマイクロカプセルの形成を促進しました。したがって、層状化は複数の水素結合と疎水性相互作用を介して発生しました。多層シェルを吸着すると、コアシェル構造を金ナノ粒子(AuNP)および/または抗体(IgG)でさらに機能化して、リモートセンシングおよび/またはターゲットデリバリーに使用できます。ポリマープライマーの存在、DNAとシルクタンパク質の濃度、および多数の吸着層など、シリカコアへの主要な高分子の順次堆積中にいくつかの重要なパラメーターを調整すると、透過性とDNA負荷が変化する生体適合性のDNAを含むマイクロカプセルが得られました。シリカコアの溶解時に、プロトコルは、カプセル膜の内面に固定化されたDNAプラスミドを有する中空で堅牢なマイクロカプセルの形成を実証した。DNAプラスミドと外部環境との間に選択的に透過性の生体適合性膜を作成することで、長期保存中にDNAを保存し、空間的に閉じ込められたプラスミドからの出力応答の改善に重要な役割を果たしました。DNAテンプレートの活性とそのアクセシビリティを、 in vitro 転写および翻訳反応(無細胞系)中にテストしました。RNAライトアップアプタマーおよびリボスイッチをコードするDNAプラスミドは、卵殻膜における蛍光標識RNA転写物またはGFPa1タンパク質の局在化中に視覚化されたように、対応するアナライトで正常に活性化されました。
Introduction
合成生物学の分野は、微生物によって進化した自然のメカニズムを利用して環境と潜在的な脅威を監視することにより、センシング機能を開発するユニークな機会を提供します。重要なことに、これらのセンシングメカニズムは通常、これらの微生物を有害な曝露から保護し、遺伝子発現を調節して悪影響を軽減したり、有毒物質の摂取を防止したりする応答に関連しています。これらの微生物を操作して、これらの自然な応答を利用して全細胞センサーを作成するが、新しいターゲットを認識したり、定量目的で測定できる測定可能なシグナルを生成したりするようにリダイレクトする多大な努力がなされてきました(通常は蛍光)1,2。現在、遺伝子組み換え微生物(GMO)の使用に関する懸念は、特に環境または人体に放出する場合、ポリマーマトリックスにカプセル化されていても、細胞全体またはその遺伝物質の一部の漏出により、これらのセンシングアプローチを利用する別の方法が必要であることを示唆しています3。
GMOの展開を心配することなく微生物ベースのセンシングの利点を活用するための強力なアプローチは、in vitro転写/翻訳(IVTT)システムの使用です。実用的な観点から、IVTTシステムは、超音波処理、ビーズビートなど、さまざまな手段で細胞から「抽出」された活性状態の細胞成分のほとんどを含む混合物で構成されています4。このプロセスの最終生成物は、転写と翻訳を実行するためにすでに最適化された生化学反応混合物であり、細胞全体の使用に関連する制約(膜拡散、形質転換効率、細胞毒性など)なしに、「オープンベッセル」フォーマットでさまざまなセンサーをテストするために使用できます。重要なのは、さまざまなセンサーコンポーネントを定量的に追加でき、その効果をさまざまな光学的および分光的手法で研究できることです(5)。IVTTシステムのパフォーマンスに一貫性がない可能性があることがわかっています。しかし、最近の研究では、それらの準備と特性評価を標準化するアプローチが示されており、センサー設計6での性能を研究する際に非常に役立ちます。最近、重金属イオン、薬物、クォーラムセンシング素子などの検出を含む、紙マトリックス中の成分の凍結乾燥を通じて紙ベースのアッセイを作成するために使用するIVTTシステムの多くの例が実証されています7,8,9。IVTTベースのセンサのエキサイティングなアプリケーションスペースは、土壌、水、人体など、さまざまなタイプの環境でのセンシングアプリケーションでの使用です。これらのIVTTシステムをこれらの困難な環境に展開するには、IVTTコンポーネントを封じ込め、劣化から保護するためのカプセル化アプローチを実装する必要があります。
IVTTシステムのための最も一般的なカプセル化アプローチには、脂質カプセル、ミセル、ポリマーソーム、および他の緊密に密閉されたマイクロ容器の使用が含まれる10、11、12。このアプローチの欠点の1つは、外部環境との通信を可能にし、センシング機能を提供するために、容器の内外に材料を輸送するためのパッシブまたはアクティブメカニズムのいずれかを組み込む必要があることです。これらの問題のいくつかを克服するために、この研究では、IVTTシステムで表現されるさまざまなセンサー設計のエンコード材料をカプセル化するためのシンプルで効果的なアプローチを提供する方法を報告します。このアプローチは、目的のプラスミドの存在下でバイオポリマーをレイヤーバイレイヤー(LbL)堆積して、高い多孔性の中空マイクロカプセルを作成することに基づいており、保護された遺伝物質が選択したIVTTのさまざまなコンポーネントと相互作用できるようにします。この研究は、カプセル化されたプラスミドが、プラスミドコードされたアプタマーとリボスイッチの対応する標的への応答で示されるように、このポリマーマトリックス内で活性化されると転写と翻訳を指示できることを実証しました。さらに、このLbLコーティングは、特別な保存条件なしでプラスミドを数ヶ月間保護します。
Protocol
Representative Results
Discussion
様々なタイプのDNAコードセンサー設計を装填した選択透過性ヒドロゲルマイクロカプセルは、このプロトコルに従って調製することができる。LbLアプローチの特徴の1つは、ボトムアップアセンブリ中にマイクロカプセルの複雑さを調整できることであり、これは通常、犠牲テンプレートへの分子種の吸着から始まります。初期成分の濃度、pH条件、および層数を注意深く調整することにより?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、空軍科学研究局からのLRIR 16RH3003J助成金、および米国国防次官研究工学事務所の軍事環境応用研究のための科学技術優先事項の進歩(ARAP)プログラムの支援を受けました。
ThyRSのプラスミドベクター配列(pSALv-RS-GFPa1、3.4 kb)は、J. Gallivan博士によって寛大に提供されました。 ボンビックスモリ のカイコの繭は、マサチューセッツ州タフツ大学のD.L.カプラン博士から寛大に寄贈されました。
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
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