Framställning av multifunktionella silkebaserade mikrokapslar laddade med DNA-plasmider som kodar för RNA-aptamerer och riboswitchar
Summary
Protokollet beskriver bildandet av robusta och biokompatibla DNA-laddade mikrokapslar som multiplexerade in vitro-biosensorer som kan spåra flera ligander.
Abstract
Vi introducerar ett protokoll för beredning av DNA-laddade mikrokapslar av silkesfibroin via monteringsmetoden Layer-by-Layer (LbL) på offersfäriska kärnor. Efter adsorption av ett primlager och DNA-plasmider underlättades bildandet av robusta mikrokapslar genom att inducera β-ark i silkes sekundära struktur under akut uttorkning av ett enda silkeskikt. Därför skedde skiktningen via flera vätebindningar och hydrofoba interaktioner. Vid adsorption av flerskiktade skal kan kärnskalstrukturerna funktionaliseras ytterligare med guldnanopartiklar (AuNP) och/eller antikroppar (IgG) för användning för fjärranalys och/eller riktad leverans. Justering av flera nyckelparametrar under sekventiell deponering av viktiga makromolekyler på kiseldioxidkärnor såsom närvaron av en polymerprimer, koncentrationen av DNA och silkeprotein, samt ett antal adsorberade skikt resulterade i biokompatibla, DNA-laddade mikrokapslar med variabel permeabilitet och DNA-belastning. Vid upplösning av kiseldioxidkärnor visade protokollet bildandet av ihåliga och robusta mikrokapslar med DNA-plasmider immobiliserade till kapselmembranets inre yta. Genom att skapa ett selektivt permeabelt biokompatibelt membran mellan DNA-plasmiderna och den yttre miljön bevarades DNA under långvarig lagring och spelade en viktig roll i det förbättrade utgångssvaret från rumsligt begränsade plasmider. DNA-mallarnas aktivitet och tillgänglighet testades under de vitro-transkription och translationsreaktioner (cellfria system). DNA-plasmider som kodar för RNA-upplysta aptamerer och riboswitchar aktiverades framgångsrikt med motsvarande analyter, vilket visualiserades under lokalisering av fluorescerande märkta RNA-transkript eller GFPa1-protein i skalmembranen.
Introduction
Området syntetisk biologi erbjuder unika möjligheter att utveckla avkänningsförmåga genom att utnyttja naturliga mekanismer som utvecklats av mikroorganismer för att övervaka deras miljö och potentiella hot. Det är viktigt att dessa avkänningsmekanismer vanligtvis är kopplade till ett svar som skyddar dessa mikroorganismer från skadlig exponering, reglerar genuttryck för att mildra negativa effekter eller förhindra intag av giftiga material. Det har gjorts betydande ansträngningar för att konstruera dessa mikroorganismer för att skapa helcellssensorer som utnyttjar dessa naturliga svar men omdirigerar dem för att känna igen nya mål och / eller producera en mätbar signal som kan mätas för kvantifieringsändamål (vanligtvis fluorescens)1,2. För närvarande tyder oro över användningen av genetiskt modifierade mikroorganismer (GMO), särskilt vid utsläpp i miljön eller människokroppen, på grund av läckage av hela celler eller en del av deras genetiska material, även om de är inkapslade i en polymermatris, att alternativa sätt att utnyttja dessa avkänningsmetoder behövs3.
Ett kraftfullt tillvägagångssätt för att utnyttja fördelarna med mikroorganismerbaserad avkänning utan att behöva oroa sig för utplacering av GMO är användningen av in vitro-transkriptions-/translationssystem (IVTT). Ur ett praktiskt perspektiv består IVTT-system av en blandning som innehåller de flesta cellkomponenterna i ett aktivt tillstånd som har “extraherats” från celler på olika sätt, inklusive ultraljudsbehandling, pärlslag eller andra4. Slutprodukten av denna process är en biokemisk reaktionsblandning som redan är optimerad för att utföra transkription och translation som kan användas för att testa olika sensorer i ett “öppet kärl” -format, utan de begränsningar som är förknippade med användningen av hela celler (membrandiffusion, transformationseffektivitet, celltoxicitet etc.). Viktigt är att olika sensorkomponenter kan tillsättas kvantitativt och deras effekt studeras med olika optiska och spektrometriska tekniker, som vi har visat5. Det har noterats att IVTT-systemens prestanda kan vara inkonsekvent; Nya studier har dock visat tillvägagångssätt för att standardisera deras förberedelse och karakterisering, vilket är till stor hjälp när man studerar deras prestanda i sensordesign6. Nyligen har många exempel på IVTT-system som används för att skapa pappersbaserade analyser genom lyofilisering av deras komponenter i pappersmatriser visats, inklusive detektion av tungmetalljoner, droger, kvorumavkänningselement och andra 7,8,9. Ett spännande applikationsutrymme för IVTT-baserade sensorer är deras användning i avkänningsapplikationer i olika typer av miljöer, inklusive mark, vatten och människokroppen. För att distribuera dessa IVTT-system till dessa utmanande miljöer måste en inkapslingsmetod implementeras för att innehålla IVTT-komponenterna och skydda dem från nedbrytning.
De vanligaste inkapslingsmetoderna för IVTT-system inkluderar användning av lipidkapslar, miceller, polymersomer och andra tätt slutna mikrobehållare10,11,12. En nackdel med detta tillvägagångssätt är behovet av att införliva antingen passiva eller aktiva mekanismer för att transportera material in och ut ur behållarna för att möjliggöra kommunikation med den yttre miljön och tillhandahålla avkänningsfunktioner. För att övervinna några av dessa problem rapporterar studien här en metod som ger ett enkelt men effektivt tillvägagångssätt för att kapsla in kodningsmaterialen för olika sensordesigner som ska uttryckas i IVTT-system. Detta tillvägagångssätt är baserat på användningen av Layer-by-Layer (LbL) deponering av en biopolymer i närvaro av plasmiderna av intresse för att skapa ihåliga mikrokapslar med hög porositet, vilket gör att det skyddade genetiska materialet kan interagera med de olika komponenterna i den valda IVTT. Studien visade att inkapslade plasmider kunde styra transkription och translation när de aktiverades i denna polymera matris, vilket visas med svaret från en plasmidkodad aptamer och en riboswitch till deras motsvarande mål. Dessutom skyddar denna LbL-beläggning plasmiderna i månader utan några speciella lagringsförhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektivt permeabla hydrogelmikrokapslar laddade med olika typer av DNA-kodade sensordesigner kan framställas enligt detta protokoll. En av de utmärkande egenskaperna hos LbL-metoden är förmågan att skräddarsy komplexiteten hos mikrokapslar under bottom-up-monteringen, som vanligtvis börjar med adsorption av molekylära arter på offermallar. Genom att noggrant justera koncentrationerna av de ursprungliga komponenterna, pH-förhållandena och antalet lager kan mikrokapslar med olika DNA-laddningsparametrar, funkti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av LRIR 16RH3003J-bidrag från Air Force Office of Scientific Research, liksom programmet Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) från U.S. Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering.
Plasmidvektorsekvensen för ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) tillhandahölls generöst av Dr. J. Gallivan. Silkesmaskkokonger från Bombyx mori donerades generöst av Dr. DL Kaplan från Tufts University, MA.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
