यह प्रोटोकॉल बताता है कि एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNAseq) प्रौद्योगिकी का उपयोग करके एकल-कोशिका स्तर पर मेजबान/रोगजनक इंटरैक्शन की विशेषता के लिए उनके एपिकल या बेसोलेटरल पक्ष से मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड को कैसे संक्रमित किया जाए ।
मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के रोगजनक संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा सेलुलर मॉडल का गठन करते हैं। इन ऑर्गेनॉइड को जीआई ट्रैक्ट के सभी वर्गों (गैस्ट्रिक, जेजुनियम, डुओडेनम, इलियम, कोलन, मलाशय) से प्राप्त किया जा सकता है और भेदभाव पर, अधिकांश कोशिका प्रकार होते हैं जो स्वाभाविक रूप से प्रत्येक अनुभाग में पाए जाते हैं। उदाहरण के लिए, आंतों के ऑर्गेनॉइड में पोषक तत्वों को अवशोषित करने वाले आंत्रसिट, स्राविक कोशिकाएं (गोबलेट, पैनेथ, और एंटेरोमोक्राइन), स्टेम सेल, साथ ही सभी वंश-विशिष्ट विभेदन मध्यवर्ती (उदाहरण के लिए, प्रारंभिक या अपरिपक्व कोशिका प्रकार) होते हैं। संक्रामक रोगों का अध्ययन करने के लिए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने में सबसे बड़ा लाभ यह है कि किस कोशिका प्रकार को आंत्र रोगजनक द्वारा लक्षित किया जाता है और यह पता लगाने की संभावना है कि गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के विभिन्न वर्ग और उनके विशिष्ट कोशिका प्रकार इसी तरह रोगजनक चुनौतियों का जवाब देते हैं या नहीं। पिछले वर्षों में, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल मॉडल, साथ ही अन्य ऊतकों से ऑर्गेनॉइड, वायरल ट्रोपिज्म और रोगजनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, अत्यधिक रोगजनक वायरस को नियोजित करते समय ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने के सभी फायदों का उपयोग करना एक तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है और सख्त जैव सुरक्षा विचारों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, जैसा कि ऑर्गेनॉइड अक्सर तीन आयामों में उगाए जाते हैं, कोशिकाओं का बेसोटेरल पक्ष ऑर्गेनॉइड के बाहर का सामना कर रहा है जबकि उनका एपिकल साइड ऑर्गेनॉइड के अंदर (ल्यूमेन) का सामना कर रहा है। यह संगठन आंत्र रोगजनकों के लिए एक चुनौती बन गया है क्योंकि कई आंत्र संक्रमण घूस के बाद कोशिकाओं के एपिकल/ल्यूमिनल पक्ष से शुरू होते हैं । निम्नलिखित पांडुलिपि कोशिका-प्रकार-विशिष्ट मेजबान/रोगजनक इंटरैक्शन की विशेषता के लिए एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण करने के लिए संक्रमण पक्ष (एपिकल बनाम बसोलेटरल) पर विचार करके आंत्रप्रेन्योर के साथ संक्रमण के लिए मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करेगी। यह विधि ऑर्गेनॉइड की तैयारी के साथ-साथ जैवसेफ्टी स्तर 3 (बीएसएल-3) रोकथाम शर्तों के तहत इस काम को करने के लिए आवश्यक विचारों का विवरण देती है।
मानव आंत्र वायरस के लिए सेल प्रकार-विशिष्ट ट्रोपिज्म और सेल प्रकार-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन प्राथमिक मानव सेलुलर मॉडल की कमी के कारण ऐतिहासिक रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। ऑर्गेनॉइड1के विकास के साथ अब यह सीमा आंशिक रूप से समाप्त हो गई है । गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के मामले में, मनुष्यों और कई अन्य प्रजातियों (जैसे, मुरीन, गोजातीय, बिल्ली के समान, चमगादड़)2,3, 4,5,6के लिए गैस्ट्रिक और आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉडल विकसित किए गए हैं। आंतों के ऑर्गेनॉइड मानव आंतों के एपिथेलियम के संरचनात्मक वास्तुकला को पुन: उत्पन्न करते हैं और इसमें क्रिप्ट और विली जैसी संरचनाएं, कार्यात्मक आंतों की वंशावली होती हैं और यहां तक कि पहले से अज्ञात सेल वंश की पहचान करने के लिए भी उपयोग किया जाता है। आंतों के ऑर्गेनॉइड को विकसित करने के लिए दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। सबसे पहले, आंतों के उपजी कोशिकाओं में क्रिप्ट होते हैं जिन्हें ऊतक रिसेक्शन या बायोप्सी से अलग किया जाता है और विशिष्ट संस्कृति स्थितियों के तहत उगाया जाता है (उदाहरण के लिए, Wnt3A, आर-स्पॉन्डिन, नोगिन, और ईजीएफ) का विस्तार करने के लिए, और फिर स्टेम कोशिकाओं को सबसे आंतों के सेल वंश(जैसे, एंटोसाइट्स, पैनेथ कोशिकाओं, गोबलेट कोशिकाओं, आंत्रप्रेन्योर सेल)7में अंतर करें। यह विधि गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट(जैसे,पेट, डुओडेनम, जेजुम, इलियम और कोलन) के सभी वर्गों से ऑर्गेनॉइड के अलगाव की अनुमति देती है। दूसरी विधि मानव-प्रेरित pluripotent या भ्रूणस्टेम कोशिकाओं पर निर्भर करती है, जिन्हें तब आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं में एक स्टेपवाइज प्रक्रिया में विभेदित किया जाता है8। इन प्रेरित स्टेम-सेल आधारित ऑर्गेनॉइड को अक्सर रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड की तुलना में प्रकृति में अधिक भ्रूणीय होने के रूप में वर्णित किया जाता है। हालांकि ये सभी ऑर्गेनॉइड मॉडल आंतों के पथ बनाने के लिए आवश्यक विकासात्मक संकेतों को जानने के लिए महत्वपूर्ण रहे हैं, संक्रामक रोग अनुसंधान में उनका उपयोग अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है।
एंटिक वायरस सभी वायरसों को कवर करने वाला एक व्यापक शब्द है, जो गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के माध्यम से संक्रमित होताहै,जैसे पिकोरनेरस (जैसे, ईवी-71), रीओवायरस (जैसे, रोटावायरस), और कैलिसिवायरस (जैसे, नोरोवायरस)9। आंत्र वायरस दूषित भोजन और पानी के घूस के माध्यम से अपने संक्रामक जीवन चक्र शुरू करते हैं, जो पर्यावरण में अनुपचारित कचरे के निर्वहन और संक्रमण10की शुरुआत के बाद चिकित्सा देखभाल की कमी के कारण विकासशील देशों में लोगों को उच्च जोखिम में छोड़ देता है । रोगजनक के प्रकार के आधार पर, संक्रमण आंतों की परत के रिसाव के कारण आंत्रशोथ, उल्टी, और/या पानी दस्त का कारण बन सकता है । मानव नोरोवायरस एक अत्यधिक प्रचलित और अत्यधिक संक्रामक आंत्र रोगजनक हैं, जोदुनियाभर में 11 मिलियन से अधिक संक्रमण और 15 मिलियन अस्पताल में भर्ती होते हैं। ऑर्गेनॉइड नोरोवायरस अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण रहे हैं क्योंकि वे मानव नोरोवायरस के संक्रमण और प्रतिकृति का समर्थन करते हैं, जो पहले मानक सेल संस्कृति मॉडल12में सुसंस्कृत होने में असमर्थ था।
पिछले दो दशकों में, कोरोनावायरस प्रमुख मानव रोगजनकों के रूप में उभरा है13। इस परिवार में अत्यधिक रोगजनक मर्स, सार्स-सीओवी-1 और सार्स-सीओवी-2 शामिल हैं, जिन्हें इन वायरसों पर शोध करते समय सख्त सुरक्षा स्तर पर रोकथाम की आवश्यकता होती है। दिलचस्प बात यह है कि जबकि इन रोगजनकों के सभी तीन ज्यादातर अपने प्रेरित श्वसन लक्षण और संकट के लिए पहचाने जाते हैं, अब यह स्पष्ट है कि इन वायरस केवल श्वसन तंत्र को संक्रमित नहीं है, लेकिन यह भी अंय अंगों । श्वसन संकट के अलावा सार्स-सीओवी-2 संक्रमित रोगियों में प्रेरित एक महत्वपूर्ण विकृति गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल लक्षणों की उपस्थिति14है। सार्स-सीओवी-2 संक्रमित रोगियों का एक अंश बहुत हल्के से लेकर गंभीर दस्त तक के लक्षण प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, सार्स-सीओवी-2 जीनोम संक्रमित रोगियों के मल और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट बायोप्सी में पता लगाया जा सकता है15। महत्वपूर्ण बात यह है कि गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल लक्षणों की उपस्थिति सार्स-सीओवी-2 तक सीमित नहीं है क्योंकि उन्हें मर्स और सार्स-सीओवी-1 संक्रमित रोगियों में भी देखा गया था। यह समझने के लिए कि सार्स-सीओवी-2 गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संकट को कैसे प्रेरित करता है और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में सार्स-सीओवी-2 के ट्रोपिज्म की ठीक पहचान करता है, मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड एक महत्वपूर्ण उपकरण रहे हैं और अब इस रोगजनक16, 17के लिए सेल प्रकार-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को जानने के लिए शोषण कियाजाताहै।
एक सेल आबादी (थोक आरएनए अनुक्रमण) का ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग मानक अभ्यास रहा है जब अमर कोशिका लाइनों के साथ-साथ ऑर्गेनॉइड दोनों के रोगजनक संक्रमणों का मूल्यांकन किया जाता है। हालांकि यह हमें रोगजनकों (जैसे, साइटोकिन्स के अपरेगुलेशन) के जवाब में वैश्विक परिवर्तनों को निर्धारित करने की अनुमति देता है, थोक आरएनएसेक हमें यह निर्धारित करने की अनुमति नहीं देता है कि जनसंख्या में विशिष्ट कोशिकाएं दूसरों की तुलना में संक्रमण से अधिक प्रवण क्यों हैं। एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNAseq) सेल वंश-विशिष्ट प्रतिलेखन कार्यक्रमों को जानने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है और यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि ये कार्यक्रम वायरस संक्रमण18,19का समर्थन या दमन कैसे करते हैं। scRNAseq का पहला वर्णन 2009 में था और इसका उपयोग माउस ब्लास्टोमेरे20में पाए जाने वाले विभिन्न कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शन प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। इन प्रौद्योगिकियों का अब विस्तार किया गया है और कई विभिन्न प्लेटफार्मों के माध्यम से लागू किया जा सकता है । इस तकनीक के प्रारंभिक संस्करणों ने अनुक्रमण के लिए अलग-अलग कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टर (FACS) लागू किया, जो अक्सर 96-या 384-अच्छी प्लेटों तक सीमित था, जिससे प्रति नमूना21का विश्लेषण करने के लिए 300 व्यक्तिगत कोशिकाएं दी जाती हैं। इन तरीकों को अब एकल-कोशिका अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा उन्नत किया गया है, जो मोतियों वाले बारकोड के साथ व्यक्तिगत बूंदों में एकल कोशिकाओं को समाहित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करते हैं। यह तकनीक प्रति नमूना स्थिति पर कब्जा करने के लिए 10,000 कोशिकाओं को अनुमति देती है।
SCRNAseq के साथ ऑर्गेनॉइड तकनीक का संयोजन हमें यह अध्ययन करने की अनुमति देता है कि आंत्र रोगजनक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट को सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से कैसे प्रभावित करते हैं। हालांकि, कई तकनीकी और जैवसेफ्टी विचारों को लेने की जरूरत है । सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण, शास्त्रीय ऑर्गेनॉइड संस्कृति विधियों (3-आयामी (3 डी) ऑर्गेनॉइड, एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड) ऑर्गेनॉइड के बाहर एपिथेलियल कोशिकाओं के बेसोलेर्टल पक्ष का पर्दाफाश करते हैं। चूंकि आंत्र रोगजनक दूषित भोजन/पानी के घूस के माध्यम से अपने संक्रमण की शुरुआत करते हैं, संक्रमण अक्सर कोशिकाओं के एपिकल साइड से शुरू होता है, जो इन 3डी आंतों के ऑर्गेनॉइड में सुलभ नहीं है । इसलिए, ऑर्गेनॉइड को रोगजनक संक्रमण के लिए एपिकल साइड को 2डी सीडिंग के माध्यम से सुलभ बनाने के लिए तैयार रहने की आवश्यकता होती है, जिससे कोशिकाओं के एपिकल साइड, या माइक्रोइंजेक्शन22, 23के माध्यम से सीधे उजागर होता है। दूसरा, संक्रमित जैविक नमूनों के scRNAseq प्रदर्शन करने के लिए, यह उनके संक्रामक प्रकृति पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । जबकि कोशिकाओं को ठीक करने और बाद में आरएनसीक्यू के लिए एकल-कोशिका अलगाव से पहले रोगजनकों को निष्क्रिय करने के तरीकों का प्रस्ताव किया गया है, इन तरीकों से अक्सर अनुक्रमण गुणवत्ता18में कमी आती है। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में संक्रमण पक्ष (एपिकल बनाम बेसोटेरल संक्रमण)(चित्रा 1)पर विचार करते हुए आंत्रप्रेन्योर वायरस के साथ आंतों के ऑर्गेनॉइड को संक्रमित करने के लिए कई दृष्टिकोणों का वर्णन किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल में scRNAseq के लिए अत्यधिक रोगजनक वायरस से संक्रमित ऑर्गेनॉइड से एकल कोशिकाओं को अलग करने और अलग करने के लिए एक कार्यप्रवाह शामिल होगा। यह प्रोटोकॉल उन प्रमुख कदमों को उजागर करेगा जिन्हें एयरोसोल की पीढ़ी और संभावित संदूषण से बचने के लिए जैवसेफ्टी स्तर-3 (बीएसएल-3) रोकथाम शर्तों के तहत काम करते समय लागू करने की आवश्यकता है ।
एंटिक रोगजनक अक्सर आंत के ल्यूमेन का सामना करते हुए आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं को संक्रमित करके अपने जीवनचक्र की शुरुआत करते हैं। जबकि ऑर्गेनॉइड को आंतों के एपिथेलियम की सेलुलर जटिलता और संगठन को पुन: पेश करने के लिए एक अच्छा मॉडल माना जाता है, त्रि-आयामी के रूप में उनका संगठन, बंद संरचनाएं रोगजनक के लिए उनकी एपिकल झिल्ली को दुर्गम बनाती हैं। इस प्रोटोकॉल में आंतों के ऑर्गेनॉइड को उनके एपिकल साइड से संक्रमित करने, उनके बेसोटेरल साइड, या बीएलएस-3 रोगजनकों दोनों के साथ दोनों को संक्रमित करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। इन प्रोटोकॉल को नीचे हाइलाइट किए गए कुछ महत्वपूर्ण चरणों का पालन करके बीएसएल-2 या बीएलएस-3 रोकथाम या किसी अन्य ऑर्गेनॉइड मॉडल के तहत किसी भी आंत्रप्रेन्योजन का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। ऊपर वर्णित विधि जर्मनी में नियमों के अनुसार एकल-कोशिका बूंदों के अलगाव और तैयारी के लिए है। एक अस्वीकरण के रूप में, यह प्रोटोकॉल जैवसेफ्टी हैंडलिंग उपायों (मानक परिचालन प्रक्रियाओं) का वर्णन नहीं करता है जिन्हें बीएसएल-3 शर्तों के तहत काम करते समय लिया जाना चाहिए। इस बात पर भी जोर देना जरूरी है कि अन्य देशों में विनियम भिन्न हो सकते हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए स्थानीय प्राधिकारियों से संपर्क किया जाना चाहिए कि सभी स्थानीय विनियमों का सम्मान किया जाए ।
एपिकल संक्रमण के लिए दो आयामों में ऑर्गेनॉइड बोने में महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह नियंत्रित कर रहा है कि शास्त्रीय त्रि-आयामी ऑर्गेनॉइड के रूप में उगाए जाने पर कोशिकाएं इसी तरह अंतर करेंगी। आंत्र रोगजनक के आधार पर, ट्रोपिज्म को बहुत दुर्लभ कोशिकाओं या कोशिकाओं तक सीमित किया जा सकता है जिन्हें अत्यधिक विभेदित करने की आवश्यकता होती है। इस मामले में, एक दो आयामी ऑर्गेनॉइड का उपयोग करना जो पूरी तरह से अंतर नहीं करता था, गलत कल्पना में परिणाम दे सकता है कि यह आंत्र रोगजनक आंतों के ऑर्गेनॉइड को संक्रमित नहीं कर सकता है। यदि संभव हो तो यह सुझाव दिया जाता है कि इस प्रोटोकॉल के तीन विन्यासों का उपयोग करके संक्रमण किया जाए: केवल एपिकल संक्रमण (धारा 2) के लिए 2D ऑर्गेनॉइड, एपिकल और बेसोलाटेरल संक्रमण (धारा 3) के लिए खुले 3डी ऑर्गेनॉइड फटा, और केवल बेसोलाटैरल संक्रमण के लिए पूर्ण 3D ऑर्गेनॉइड (धारा 3)। यह दृष्टिकोण रोगजनक (एपिकल बनाम बसोलेटरल) के प्रवेश मार्ग को समझने में मदद करेगा और यह भी नियंत्रित करेगा कि भेदभाव का एक समान स्तर हासिल किया गया है। 2डी एपिकल संक्रमण के लिए एक विकल्प माइक्रोइंजेक्शन है, जो 3डी ऑर्गेनॉइड का उपयोग करेगा लेकिन रोगजनक को सीधे एपिकल साइड में वितरित करेगा (विवरण के लिए बार्टफेल्ड एट अल27 देखें)। इस विधि के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए एक कुशल इंजेक्टर की आवश्यकता होती है कि रोगजनक ठीक से रखा गया है, और ऑर्गेनॉइड बरकरार रहते हैं। माइक्रोइंजेक्शन आमतौर पर बीएसएल-2 रोकथाम में प्रयोग किया जाता है और बीएसएल-3 रोकथाम के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है।
2डी वरीयता प्राप्त ऑर्गेनॉइड में संक्रमण प्रयोग करते समय एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण विचार अंतिम कोशिका घनत्व है। जैसा कि चरण 2.3 में उल्लेख किया गया है, 100-150 ऑर्गेनॉइड को 48-अच्छी प्लेट या 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड के एक कुएं में वरीयता दी जाएगी। ऑर्गेनॉइड लाइन के आधार पर और ऑर्गेनॉइड को संभालने वाले व्यक्ति पर, इन ऑर्गेनॉइड का आकार काफी अलग हो सकता है। यह 48-अच्छी तरह से प्लेट या 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड में बहुत अलग सेल घनत्व में परिणाम दे सकता है। आंत्र वायरस के आधार पर, कुछ वायरस अधिक विरल कोशिकाओं को पसंद करते हैं, जबकि अन्य भी कन्फ्लेंट कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम होंगे। विभिन्न कोशिका संगमों के लिए संक्रमितता में इस तरह के अंतर की आणविक उत्पत्ति स्पष्ट नहीं है; इसलिए, पसंद के आंत्र रोगजनक के लिए सबसे अच्छा सेल घनत्व खोजने के उद्देश्य से पायलट प्रयोगों को आगे डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन करने से पहले किया जाना चाहिए।
अक्सर एकल सेल बूंद पायस प्रदर्शन करने से पहले FACS छंटाई की जाती है। इस चरण का उपयोग अक्सर जीवित कोशिकाओं और एकल कोशिकाओं से डबल्स से मृत को अलग करने के लिए किया जाता है। बीएसएल-3 रोगजनकों के साथ काम करते समय, इसके लिए आवश्यक है कि सुविधा एक उपयुक्त FACS सॉर्टर से लैस है, जो अक्सर मामला नहीं होता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड में सभी कोशिकाओं का आकार समान नहीं होता है, और अक्सर डबल या बड़े सेल के बीच भेदभाव करना मुश्किल होता है, जिससे एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के खिलाफ नकारात्मक चयन का जोखिम होता है। इसके अलावा, इस क्षेत्र में अभी भी चर्चा है कि क्या प्रत्येक नमूने के लिए 5000-10,000 के बीच छंटाई के लिए आवश्यक समय व्यक्तिगत कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्ट प्रोफाइल का एक महत्वपूर्ण संशोधन में परिणाम सकता है । जबकि सेल निर्धारण के तरीकों को एकल-कोशिका अनुक्रमण (जैसे, मेथनॉल और आरएनएसिस्ट) के साथ संगत किया गया है, यह देखा गया कि इससे अनुक्रमण18की गुणवत्ता में कमी आती है। अंत में, यह संदेह है कि सेल डेथ मार्कर का उपयोग करके कोशिकाओं को छांटने से भी पूर्वाग्रह पैदा हो सकता है। तहखाना-विली धुरी के माध्यम से कोशिकाओं के दिशात्मक प्रसार और भेदभाव को देखते हुए, सबसे विभेदित कोशिकाएं, जो बहाने और जारी होने जा रही हैं, विली की नोक पर स्थित हैं। ये कोशिकाएं अक्सर सेल डेथ पाथवे(जैसे, एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस और नेक्रोटोसिस) के विभिन्न मार्कर के लिए सकारात्मक होती हैं; हालांकि, जब माउस आंत के रोटावायरस संक्रमण को देखते हुए, विली की नोक सबसे संक्रमित क्षेत्र28है . इस प्रकार, उन कोशिकाओं को फ़िल्टर करना जो मृत्यु मार्कर के लिए सकारात्मक लग सकती हैं, इसके परिणामस्वरूप संक्रमित कोशिकाओं का नकारात्मक चयन होगा जो शारीरिक संक्रमण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। वर्तमान में, एकल कोशिका अनुक्रमण से पहले ऑर्गेनॉइड को छांटने और ठीक करने के लिए कोई अच्छा समाधान नहीं है। लाइव, अनसुलझे कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि उपयुक्त वैकल्पिक प्रोटोकॉल खोजने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होती है।
एकल-कोशिका अनुक्रमण ने इस बात में क्रांति ला दी है कि सेलुलर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कैसे किया जा सकता है। यह तकनीक बेसल स्थितियों और रोगजनक संक्रमणों के तहत सेल वंश-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की पहचान के लिए अनुमति देती है। इस विधि ने कई क्षेत्रों में दरवाजे खोले हैं जो पहले थोक रीडआउट द्वारा सीमित थे। जबकि यह विधि बहुत शक्तिशाली है, इसकी अपनी सीमाएं हैं। एक प्रमुख सीमा व्यापक जैव सूचना विश्लेषण है जो अनुक्रमण के डाउनस्ट्रीम की आवश्यकता है। ऊतकों का विश्लेषण करते समय और सेल प्रकारों को निर्दिष्ट करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां वर्तमान में कोई एनोटेशन नहीं है। सभी एकल-कोशिका अध्ययनों का समर्थन करने के लिए एक कुशल बायोइन्फॉर्मेटिक्स होना आवश्यक है।
यह प्रोटोकॉल मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड को बीज और संभालने, उन्हें आंत्र रोगजनकों से संक्रमित करने और scRNAseq प्रदर्शन करने का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण को अन्य अंगों के अनुकूल बनाना अब संभव है, क्योंकि अधिकांश अंगों के लिए ऑर्गेनॉइड मॉडल सिस्टम विकसित किए गए हैं। फेफड़े और जिगर ऑर्गेनॉइड इसी तरह आंतों के ऑर्गेनॉइड की तुलना में आयोजित किए जाते हैं, और इस प्रकार, एक अनुरूप दृष्टिकोण का उपयोग करके इन ऑर्गेनॉइड को स्थानांतरित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण नियंत्रण यह मान्य करना होगा कि जब दो आयामों में उगाया जाता है या खुला फटा जाता है, तो ये ऑर्गेनॉइड अपने 3 डी ऑर्गेनॉइड समकक्षों के रूप में समान भेदभाव प्राप्त करते हैं। विशिष्ट विशेषताएं और जीन जो एक विभेदित स्थिति को परिभाषित करते हैं, प्रत्येक अंग मॉडल के लिए विशिष्ट हैं। गुर्दे और संवहनी ऑर्गेनॉइड, बड़ी घने संरचनाओं जैसे अन्य ऑर्गेनॉइड मॉडल को इन संरचनाओं को एकल कोशिकाओं में क्रमिक रूप से अलग करने के लिए अतिरिक्त तरीकों की आवश्यकता होगी।
The authors have nothing to disclose.
मेगन स्टैनिफर और स्टीव बोल्डेंट को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमिन्सचैफ्ट (डीएफजी) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: (परियोजना संख्या 240245660, 278001972, 415089553, और 272983813 Steeve Boulant और मेगन स्टैनिफर के लिए 416072091), Baden-Wuertemberg और Bundesministerium für Bildung und Forschung BF 01KI20239B के लिए एमएस और 01KI20198A और (NUM-COVID 19, के राज्य ऑर्गेनो-स्ट्रैट 01KX2021) से एसबी स्कीमेटिक्स को बायोडरेर में बनाया गया था।
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |