Detta protokoll beskriver hur man infekterar mänskliga intestinala organoider från antingen deras apikala eller basolateral sida för att karakterisera värd/patogen interaktioner på encells nivå med hjälp av encelliga RNA sekvensering (scRNAseq) teknik.
Mänskliga intestinala organoider utgör den bästa cellulära modellen för att studera patogeninfektioner i mag-tarmkanalen. Dessa organoider kan härledas från alla delar av mag-tarmkanalen (magsäck, jejunum, tolvfingertarms, ileum, kolon, ändtarm) och, vid differentiering, innehålla de flesta av de celltyper som finns naturligt i varje enskilt avsnitt. Till exempel innehåller intestinala organoider näringsabsorberande enterocyter, sekretoriska celler (bägare, Paneth och enteroendokrina), stamceller, liksom alla härstamningsspecifika differentieringsintermediärer (t.ex. tidiga eller omogna celltyper). Den största fördelen med att använda mag-tarmkanalen-härledda organoider för att studera infektionssjukdomar är möjligheten att exakt identifiera vilken celltyp som är inriktad på den enteriska patogenen och att ta itu med om de olika delarna av mag-tarmkanalen och deras specifika celltyper på samma sätt svarar på patogena utmaningar. Under de senaste åren har gastrointestinala modeller, liksom organoider från andra vävnader, använts för att studera viral tropism och mekanismerna för patogenes. Att utnyttja alla fördelar med att använda organoider vid användning av högpatogena virus utgör dock en teknisk utmaning och kräver strikta biosäkerhetsöverväganden. Dessutom, eftersom organoider ofta odlas i tre dimensioner, är cellernas basolaterala sida vänd mot utsidan av organoiden medan deras apikala sida är vänd mot insidan (lumen) av organoiderna. Denna organisation utgör en utmaning för enteriska patogener som många enteric infektioner initiera från den apikala/luminal sidan av cellerna efter intag. Följande manuskript kommer att ge ett omfattande protokoll för att förbereda mänskliga intestinala organoider för infektion med enteriska patogener genom att överväga infektionssidan (apical vs. basolateral) för att utföra encells RNA-sekvensering för att karakterisera celltypspecifika värd-/patogeninteraktioner. Denna metod beskriver beredningen av organoiderna samt de överväganden som behövs för att utföra detta arbete under biosäkerhet nivå 3 (BSL-3) inneslutning villkor.
Att studera celltypspecifik tropism och celltypspecifikt immunsvar mot mänskliga enteriska virus har varit historiskt utmanande på grund av bristen på primära mänskliga cellulära modeller. Denna begränsning har nu delvis utrotats med utvecklingen av organoider1. När det gäller mag-tarmkanalen har mag- och tarmorganoidmodeller utvecklats för människor och flera andra arter (t.ex. murin, nötkreatur, kattdjur, fladdermus)2, 3,4,5,6. Intestinala organoider reproducerar den strukturella arkitekturen i den mänskliga intestinala epitel och innehåller krypta och villi-liknande strukturer, funktionella intestinala härstamningar och har även använts för att identifiera tidigare okända cell härstamningar. Två olika tillvägagångssätt kan användas för att odla intestinala organoider. För det första isoleras tarmstamceller som innehåller krypter från vävnadsresektioner eller tarmbiopsier och odlas under specifika odlingsförhållanden (t.ex. Wnt3A, R-spondin, Noggin och EGF) för att expandera och sedan differentiera stamcellerna till de flesta tarmcellsstammar (t.ex. enterocyter, Paneth-celler, Goblet-celler, enteroendokrina celler)7. Denna metod möjliggör isolering av organoider från alla delar av mag-tarmkanalen (t.ex.magsäck,tolvfingertarms, jejunum, ileum och tjocktarm). Den andra metoden bygger på humaninducerade pluripotenta eller embryonala stamceller, som sedan differentieras i en stegvis process i intestinala epitelceller8. Dessa inducerade stamcellsbaserade organoider beskrivs ofta som mer embryonala till sin natur jämfört med patient-härledda organoider. Medan alla dessa organoida modeller har varit avgörande för att riva upp utvecklingssignaler som behövs för att bilda tarmkanalen, är deras användning i infektionssjukdomsforskning fortfarande i sin linda.
Enteriskt virus är en bred term som täcker alla virus, som infekterar genom mag-tarmkanalen, såsom picornavirus (t.ex. , EV-71), reovirus (t.ex. rotavirus) och calicivirus (t.ex. norovirus)9. Enteriska virus initierar sin infektiösa livscykel genom intag av förorenad mat och vatten, vilket lämnar människor i utvecklingsländer i hög risk på grund av utsläpp av obehandlat avfall i miljön och brist på medicinsk vård efter infektionens början10. Beroende på typen av patogen kan infektionen leda till gastroenterit, kräkningar och/ eller vattnig diarré på grund av läckage av tarmfodret. Mänskliga norovirus är en mycket utbredd och mycket smittsam enterisk patogen, som leder till över 600 miljoner infektioner och 15 miljoner sjukhusvistelser över hela världen11. Organoider har varit nyckeln till norovirusforskning eftersom de stöder infektion och replikering av humant norovirus, som tidigare inte kunde odlas i standardcellkulturmodeller12.
Under de senaste två decennierna har coronavirus dykt upp som viktiga mänskliga patogener13. Denna familj inkluderar den högpatogena MERS, SARS-CoV-1 och SARS-CoV-2, som kräver strikta säkerhetsnivå inneslutningar när man utför forskning om dessa virus. Intressant, medan alla tre av dessa patogener är mestadels erkända för sina inducerade andningssymtom och ångest, är det nu uppenbart att dessa virus inte bara infekterar andningsorganen utan också andra organ. En viktig patologi inducerad hos SARS-CoV-2 infekterade patienter förutom andningsbesvär är närvaron av gastrointestinala symtom14. En bråkdel av SARS-CoV-2 infekterade patienter visar sådana symtom, allt från mycket mild till svår diarré. Dessutom kan SARS-CoV-2 genom detekteras i avföring och mag-tarmkanalen tarmbiopsier hos infekterade patienter15. Viktigt är att förekomsten av gastrointestinala symtom inte är begränsad till SARS- CoV-2 eftersom de också observerades hos MERS- och SARS- CoV- 1 infekterade patienter. För att förstå hur SARS-CoV-2 inducerar gastrointestinal nöd och exakt identifiera tropismen hos SARS-CoV-2 i mag-tarmkanalen, har mänskliga intestinala organoider varit ett viktigt verktyg och utnyttjas nu för att nysta upp celltypspecifika svar på denna patogen16,17.
Transkriptionell profilering av en cellpopulation (bulk RNA-sekvensering) har varit standardpraxis vid utvärdering av patogeninfektioner av både odödliga cellinjer samt med organoider. Även om detta gör det möjligt för oss att bestämma globala förändringar som svar på patogener (t.ex. uppreglering av cytokiner), tillåter bulk RNAseq oss inte att avgöra varför specifika celler i en population är mer benägna att infektion än andra. Encellig RNA-sekvensering (scRNAseq) har blivit ett kraftfullt verktyg för att nysta upp celllinjespecifika transkriptionsprogram och kan användas för att bestämma hur dessa program stöder eller undertrycker virusinfektion18,19. Den första beskrivningen av scRNAseq var 2009 och användes för att utvärdera transkriptionsprofilerna för de olika cellerna som finns i en mus blastomere20. Dessa tekniker har nu utökats och kan implementeras via flera olika plattformar. Tidiga versioner av denna teknik tillämpade fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) för att separera enskilda celler för sekvensering, som ofta begränsades till 96- eller 384-brunnsplattor, vilket gav 300 enskilda celler att analysera per prov21. Dessa metoder har nu utvecklats av encellssekvenseringsplattformarna, som använder en mikrofluidisk enhet för att kapsla in enskilda celler i enskilda droppar med streckkod som innehåller pärlor. Denna teknik gör det möjligt att fånga upp till 10 000 celler per provtillstånd.
Genom att kombinera organoidteknik med scRNAseq kan vi studera hur enteriska patogener påverkar mag-tarmkanalen på ett celltypspecifikt sätt. Flera tekniska och biosäkerhetsmässiga överväganden måste dock beaktas. Först och främst exponerar klassiska organoider kulturmetoder (3-dimensionella (3D) organoider, inbäddade i en extracellulär matris (ECM)) den grundläggande sidan av epitelcellerna till utsidan av organoiden. Som enteriska patogener initierar sin infektion genom intag av förorenad mat / vatten, infektionen initierar oftast från den apikala sidan av cellerna, som inte är tillgänglig i dessa 3D intestinala organoider. Därför måste organoider vara beredda att göra den apikala sidan tillgänglig för patogeninfektion antingen genom 2D-sådd, vilket direkt exponerar cellernas apikala sida eller genom mikroinjektion22,23. För det andra, för att utföra scRNAseq av infekterade biologiska prover, är det viktigt att överväga deras smittsamma natur. Medan metoder för att fixa celler och inaktivera patogener före encellsisolering för efterföljande RNAseq har föreslagits, leder dessa metoder ofta till en minskning av sekvenseringskvaliteten18. Protokollet nedan kommer att beskriva flera metoder för att infektera intestinala organoider med enteriska virus med tanke på infektionssidan (apikal kontra basolateral infektion) (figur 1). Dessutom kommer protokollet att innehålla ett arbetsflöde för att dissociera och isolera enstaka celler från organoider infekterade med högpatogena virus för scRNAseq. Protokollet kommer att belysa de viktigaste stegen som måste genomföras vid arbete under biosäkerhetsnivå-3 (BSL-3) inneslutningsvillkor för att undvika generering av aerosoler och potentiell förorening.
Enteriska patogener initierar oftast sin livscykel genom att infektera intestinala epitelceller från deras apikala sida mot tarmens lumen. Medan organoider är välkända för att vara en bra modell för att reproducera den cellulära komplexiteten och organisationen av tarmepitelet, gör deras organisation som tredimensionella, slutna strukturer deras apikala membran otillgängliga för patogenen. Detta protokoll beskrivs metoder för att infektera intestinala organoider från deras apikala sida, deras basolateral sida, eller båda med BLS-3 patogener. Dessa protokoll kan enkelt anpassas för att studera någon enterisk patogen under BSL-2 eller BLS-3 inneslutning eller någon annan organoid modell genom att följa några kritiska steg som markeras nedan. Den metod som beskrivs ovan är för isolering och beredning av encellsdroppar i enlighet med bestämmelserna i Tyskland. Som en ansvarsfriskrivning beskriver detta protokoll inte de åtgärder för hantering av biosäkerhet (standardrutiner) som måste vidtas när du arbetar under BSL-3-förhållanden. Det är också viktigt att insistera på att bestämmelserna kan variera i andra länder och att de lokala myndigheterna måste kontaktas för att se till att alla lokala bestämmelser respekteras.
Ett av de kritiska stegen i sådd av organoider i två dimensioner för apikal infektion är att kontrollera att celler på samma sätt kommer att skilja sig åt jämfört med när de odlas som klassiska tredimensionella organoider. Beroende på enterisk patogen, tropism kan begränsas till mycket sällsynta celler eller till celler som behöver vara mycket differentierade. I detta fall, med hjälp av en tvådimensionell organoid som inte helt differentierade kan resultera i missuppfattningen att denna enteriska patogen inte kan infektera intestinala organoider. Det föreslås, om möjligt, att utföra infektioner med hjälp av de tre konfigurationerna av detta protokoll: 2D organoid för apikal infektion endast (avsnitt 2), spruckna öppna 3D organoider för apikal och basolateral infektion (avsnitt 3) och fullständiga 3D organoider för basolateral infektion endast (avsnitt 3). Detta tillvägagångssätt kommer att bidra till att urskilja patogenens ingångsväg (apical vs. basolateral) och kommer också att kontrollera att en liknande differentieringsnivå har uppnåtts. Ett alternativ för 2D-apikal infektion är mikroinjektion, som kommer att använda en 3D-organoid men leverera patogenen direkt till den apikala sidan (se Bartfeld m.fl.27 för detaljer). Denna metod kräver en skicklig injektor för att säkerställa att patogenen är korrekt placerad och organoiderna förblir intakta. Mikroinjektion används ofta i BSL-2 inneslutning och kanske inte är lämplig för BSL-3 inneslutning.
En ytterligare viktig faktor när man utför infektionsexperiment i 2D-seedade organoider är den slutliga celltätheten. Som nämnts i steg 2.3 kommer 100-150 organoider att sås i en brunn på en 48-brunnsplatta eller en brunn i en 8-väl glasbottenkammarerutschbana. Beroende på organoidlinjen och på den person som hanterar organoiderna kan storleken på dessa organoider vara betydligt annorlunda. Detta kan resultera i mycket olika celltätheter i 48-brunnsplattan eller 8-brunns glasbottenkammaren. Beroende på det enteriska viruset föredrar vissa virus mer glesa celler, medan andra också kommer att kunna infektera sammanflödesceller. Det molekylära ursprunget till sådana skillnader i smittsamhet för olika cellkonfluenser är inte klart; Därför bör pilotexperiment som syftar till att hitta den bästa celltätheten för den enteriska patogenen utföras innan ytterligare nedströms karakterisering utförs.
Ofta utförs FACS-sortering innan du utför encellsdropparmulsionen. Detta steg används ofta för att separera döda från levande celler och enskilda celler från dubbletter. Vid arbete med BSL-3 patogener kräver det att anläggningen är utrustad med en lämplig FACS-sorterare, vilket inte ofta är fallet. Dessutom har inte alla celler i en organoid samma storlek, och det är ofta svårt att skilja mellan en doublet eller en större cell, vilket orsakar en risk för att negativt välja mot en viss celltyp. Det finns också fortfarande diskussioner i fältet om den tid som behövs för att sortera mellan 5 000-10 000 för varje prov kan resultera i en betydande ändring av transkriptionsprofilen för de enskilda cellerna. Medan cellfixeringsmetoder som är kompatibla med encellssekvensering (t.ex. metanol och RNAassist) har beskrivits, observerades det att detta leder till en minskning av kvaliteten på sekvensering18. Slutligen misstänks det att sortering av celler med hjälp av celldödsmarkörer också kan leda till en partiskhet. Med tanke på cellernas riktningsproliferation och differentiering genom krypt-villi-axeln ligger de mest differentierade cellerna, som kommer att kastas och släppas, vid villis spets. Dessa celler är ofta positiva för olika markörer för celldödsvägar (t.ex. apoptos, nekros och nekroptos); Men när man tittar på rotavirusinfektion i mustarmen är spetsen på villi det mest infekterade området28. Således skulle filtrering av celler som kan se positiva ut för dödsmarkörer resultera i ett negativt urval av de infekterade cellerna som kan representera den fysiologiska infektionen. För närvarande finns det ingen bra lösning för sortering och fixering av organoider före encellig sekvensering. Användning av levande, osorterade celler rekommenderas eftersom ytterligare studier behövs för att hitta lämpliga alternativa protokoll.
Encellig sekvensering har revolutionerat hur cellulära svar kan utvärderas. Denna teknik möjliggör identifiering av cell härstamning-specifika svar både i basala förhållanden och under patogen infektioner. Denna metod har öppnat dörrar inom många områden som tidigare begränsades av massläsningar. Även om denna metod är mycket kraftfull, har den sina begränsningar. En viktig begränsning är den omfattande bioinformatiska analys som krävs nedströms sekvenseringen. Detta är särskilt viktigt när du analyserar vävnader och tilldelar celltyper där det för närvarande inte finns någon anteckning. Att ha en skicklig bioinformatiker krävs för att stödja alla encellsstudier.
Detta protokoll beskriver hur man frö och hanterar mänskliga intestinala organoider, infekterar dem med enteriska patogener och utför scRNAseq. Att anpassa detta tillvägagångssätt till andra organ är nu möjligt, eftersom organoida modellsystem har utvecklats för de flesta organ. Lung- och leverorganoider är på samma sätt organiserade jämfört med intestinala organoider, och som sådan, med hjälp av ett analogt tillvägagångssätt kan överföras till dessa organoider. Den kritiska kontrollen kommer att vara att validera att när de odlas i två dimensioner eller spricker öppna, uppnår dessa organoider liknande differentiering som deras 3D-organoida motsvarigheter. De specifika egenskaper och gener som definierar en differentierad status är specifika för varje organmodell. Andra organoida modeller som njure och kärlorganoider, stora täta strukturer, kommer att behöva ytterligare metoder för att seriellt separera dessa strukturer i enstaka celler.
The authors have nothing to disclose.
Megan Stanifer och Steeve Boulant stöddes av forskningsanslag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Projektnummer 240245660, 278001972, 415089553 och 272983813 till Steeve Boulant och 416072091 till Megan Stanifer), delstaten Baden-Wuerttemberg och Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B till MS och 01KI20198A och (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) till SB. Schematics skapades i BioRender.
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |