Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen effizienten und reproduzierbaren Ansatz für histologische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung.
Abstract
Die immunhistochemische Färbung von Mäusegehirnen ist eine Routinetechnik, die häufig in den Neurowissenschaften verwendet wird, um zentrale Mechanismen zu untersuchen, die der Regulation des Energiestoffwechsels und anderer neurobiologischer Prozesse zugrunde liegen. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Hirnhistologie kann jedoch zwischen den Labors variieren. Für jedes Färbeexperiment ist es notwendig, die Schlüsselverfahren basierend auf Unterschieden in Spezies, Geweben, Zielproteinen und den Arbeitsbedingungen der Reagenzien zu optimieren. Dieses Papier demonstriert einen zuverlässigen Workflow im Detail, einschließlich intraaortaler Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebender Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung, die von Forschern auf diesem Gebiet leicht verfolgt werden können.
Diskutiert wird auch, wie diese Verfahren modifiziert werden können, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden. Um die Zuverlässigkeit und Effizienz dieses Protokolls zu veranschaulichen, wurden perineuronale Netze mit Biotin-markiertem Wisteria florbunda agglutinin (WFA) und Arginin-Vasopressin (AVP) mit einem Anti-AVP-Antikörper im Mausgehirn gefärbt. Schließlich wurden die kritischen Details für das gesamte Verfahren und die Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu denen anderer Protokolle angesprochen. Zusammengenommen stellt dieser Artikel ein optimiertes Protokoll für die frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirngewebe vor. Die Einhaltung dieses Protokolls erleichtert diesen Prozess sowohl für Nachwuchs- als auch für Senior-Wissenschaftler, um die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Immunostaining-Studien zu verbessern.
Introduction
Die Prävalenz von Fettleibigkeit und damit verbundenen Komorbiditäten hat epidemische Ausmaße erreicht, was zu einer enormen sozioökonomischen Belastung führt1,2. Verschiedene Mausmodelle wurden entwickelt, um die biologischen Prozesse, die für Fettleibigkeit verantwortlich sind, besser zu verstehen3,4. Da in diesen Tiermodellen zentrale Mechanismen für die Regulation der Energiehomöostase wichtig sind, sind neuroanatomische Untersuchungen von Mausgehirnen zu einer notwendigen Technik auf diesem Gebiet geworden. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Hirnhistologietechniken variieren jedoch aus verschiedenen Gründen (z. B. Antikörper, Gewebe, Behandlungen, Spezies, Forschungsziele) erheblich zwischen Labors und sogar Forschern innerhalb desselben Labors. Daher ist es notwendig, ein allgemeines Protokoll für histologische Studien des Mausgehirns festzulegen, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung. In der Zwischenzeit können Anfänger dieses Protokoll schnell erlernen, beherrschen und anpassen, um ihre individuellen Bedürfnisse zu erfüllen.
Die immunhistochemische Färbung ist eine etablierte Methode, die umfassend verwendet wurde, um spezifische Zelltypen, mRNAs und Proteine in einer Vielzahl von Geweben (z. B. Gehirn und periphere Gewebe) zu visualisieren5,6. Genauer gesagt kann ein Antigen von Interesse durch einen spezifischen primären Antikörper und einen entsprechenden sekundären Antikörper markiert werden, der mit einem Enzym (z. B. chromogener Immunhistochemie) oder einem fluoreszierenden Farbstoff (Fluoresceinisothiocyanat) verbunden ist6. Als Beispiel für den Nutzen dieser Techniken wurden β-Endorphin [ein Peptid, das von Pro-Opiomelanocortin (POMC) kodiert wird] und c-fos (ein Marker für neuronale Aktivität) im Bogenkern gefärbt. Es wurde gezeigt, dass die Deletion von Tryptophanhydroxylase 2 (ein enzymintegrante Serotoninsynthese) im dorsalen Raphe-Kern die c-fos-Expression in POMC-Neuronen im bogenförmigen Kern verringert7. Zusätzlich wurde die Verteilung der Vitamin-D-Rezeptor-mRNA im Mausgehirn mittels In-situ-Hybridisierung (RNAscope)8 kartiert. Dieser Beitrag stellt eine zuverlässige und effiziente Methode mit einem Schritt-für-Schritt-Workflow für die frei schwebende Immunfärbung vor, die darauf abzielt, die Qualität und Reproduzierbarkeit histologischer Studien des Mausgehirns zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode für neuroanatomische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Gewebeschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung. Einige wichtige Details, die für konsistente und zuverlässige Ergebnisse unerlässlich sind, müssen jedoch optimiert werden.
Die Qualität der Perfusion ist entscheidend für eine erfolgreiche Färbung. Die Färbeergebnisse können beeinträchtigt werden, wenn Blut im Gehirn verbleibt, da Blutkö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forscher wurden durch Zuschüsse des NIH unterstützt (K01DK119471 an CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 und R01DK120858 an YX), USDA/CRIS (51000-064-01S an YX) und American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) an LT.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
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