Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen
Summary
Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.
Abstract
Entomopathogene schimmels (EPF) zijn een van de microbiële bestrijders voor geïntegreerde plaagbestrijding. Om lokale of invasieve plagen te bestrijden, is het belangrijk om inheemse EPF te isoleren en te selecteren. Daarom werd de bodemaasmethode in combinatie met het insectenaas (meelworm, Tenebrio molitor) -systeem in deze studie met enkele aanpassingen gebruikt. De geïsoleerde EPF werd vervolgens onderworpen aan de virulentietest tegen de landbouwplaag Spodoptera litura. Bovendien werden de potentiële EPF-stammen onderworpen aan morfologische en moleculaire identificaties. Daarnaast werden de conidiaproductie en thermotolerantietest uitgevoerd voor de veelbelovende EPF-stammen en vergeleken; deze gegevens werden verder vervangen door de formule van effectief conidia-nummer (ECN) voor laboratoriumrangschikking. Het bodemaasmeelwormsysteem en de ECN-formule kunnen worden verbeterd door insectensoorten te vervangen en meer stressfactoren te integreren voor de evaluatie van commercialisering en veldtoepassing. Dit protocol biedt een snelle en efficiënte aanpak voor EPF-selectie en zal het onderzoek naar biologische bestrijders verbeteren.
Introduction
Momenteel worden entomopathogene schimmels (EPF) veel gebruikt bij de microbiële bestrijding van landbouw-, bos- en tuinbouwplagen. De voordelen van EPF zijn het brede gastheerbereik, het goede aanpassingsvermogen van het milieu, de milieuvriendelijke aard en dat het kan worden gebruikt met andere chemicaliën om het synergetische effect voor geïntegreerde plaagbestrijding aan te tonen1,2. Voor de toepassing als ongediertebestrijder is het noodzakelijk om een groot aantal EPF te isoleren van zieke insecten of de natuurlijke omgeving.
De bemonstering van deze organismen van hun gastheren helpt bij het begrijpen van de geografische verspreiding en prevalentie van EPF in natuurlijke gastheren3,4,5. De verzameling van met schimmel geïnfecteerde insecten wordt echter meestal beperkt door omgevingsfactoren en insectenpopulaties in het veld4. Gezien het feit dat insectengastheren na EPF-infectie zullen sterven en vervolgens in de grond zullen vallen, kan isolatie van EPF uit bodemmonsters een stabiele hulpbron zijn3,6. Van saprofyten is bijvoorbeeld bekend dat ze de dode gastheer gebruiken als hun bron voor groei. De bodemaas- en selectieve mediumsystemen zijn op grote schaal gebruikt om EPF uit de bodem te detecteren en te isoleren3,4,7,8,9,10.
Bij de selectieve mediummethode wordt de verdunde bodemoplossing op een medium geplaatst dat breedspectrumantibiotica bevat (bijv. chlooramfenicol, tetracycline of streptomycine) om de groei van bacteriën te remmen2,3,9,11. Er is echter gemeld dat deze methode de diversiteit en dichtheid van de stam kan verstoren en een over- of onderschatting van veel microbiële gemeenschappen kan veroorzaken6. Bovendien zijn de geïsoleerde stammen minder pathogeen en concurreren ze tijdens isolatie met saprofyten. Het is moeilijk om EPF te isoleren uit de verdunde bodemoplossing3. In plaats van een selectief medium te gebruiken, isoleert de bodemaasmethode EPF van de geïnfecteerde dode insecten, die 2-3 weken kunnen worden bewaard, waardoor een efficiëntere en standaard EPF-scheidingsmethode wordt geboden3,4,7,6. Omdat de methode eenvoudig te bedienen is, kan men een verscheidenheid aan pathogene stammen isoleren tegen lage kosten4. Daarom wordt het veel gebruikt door veel onderzoekers.
Bij het vergelijken van de verschillende soorten insectenaassystemen zijn Beauveria bassiana en Metarhizium anisopliae de meest voorkomende EPF-soorten die worden aangetroffen in insecten die behoren tot de Hemiptera, Lepidoptera, Blattella en Coleoptera6,12,13,14. Onder deze insectenaas vertonen Galleria mellonella (orde Lepidoptera) en Tenebrio molitor (orde Coleoptera) hogere herstelpercentages van Beauveria en Metarhizium spp., in vergelijking met andere insecten. Daarom worden G. mellonella en T. molitor vaak gebruikt voor het lokken van insecten. In de loop der jaren heeft het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) een EPF-bibliotheek (Agricultural Research Service Collection of EPF-culturen, ARSEF) opgericht die een grote verscheidenheid aan soorten bevat, waaronder 4081 soorten Beauveria spp., 18 soorten Clonostachys spp., 878 soorten Cordyceps spp., 2473 soorten Metarhizium spp., 226 soorten Purpureocillium spp., en 13 soorten Pochonia spp. onder andere15. Een andere EPF-bibliotheek werd gebouwd door het Entomology Research Laboratory (ERL) van de Universiteit van Vermont in de Verenigde Staten voor c.a. 30 jaar. Het omvat 1345 stammen van EPF uit de Verenigde Staten, Europa, Azië, Afrika en het Midden-Oosten16.
Om lokale of invasieplagen in Taiwan te bestrijden, is isolatie en selectie van inheemse EPF vereist. Daarom hebben we in dit protocol de procedure van de bodemaasmethode aangepast en beschreven en gecombineerd met het insectenaas (meelworm, Tenebrio molitor) –systeem17. Op basis van dit protocol werd een EPF-bibliotheek opgericht. Twee screeningsrondes (kwantificering van inenting) werden uitgevoerd voor de voorlopige EPF-isolaten. EPF-isolaten vertoonden pathogeniciteit voor insecten. De potentiële stammen werden onderworpen aan morfologische en moleculaire identificaties en verder geanalyseerd door de thermotolerantie en conidiale productietest. Verder werd ook een concept van effectief conidia-nummer (ECN) voorgesteld. Met behulp van ECN-formule en principal component analysis (PCA) werden de potentiële stammen geanalyseerd onder gesimuleerde omgevingsdruk om het proces van het opzetten en screenen van de EPF-bibliotheek te voltooien. Vervolgens werd de pathogeniciteit van veelbelovende EPF-stammen getest op de doelplaag (bijv. Spodoptera litura). Het huidige protocol integreert thermotolerantie en conidiale productiegegevens in de ECN-formule en PCA-analyse, die kunnen worden gebruikt als een standaardrangschikkingssysteem voor EPF-gerelateerd onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entomopathogene schimmels (EPF) zijn gebruikt voor insectenbestrijding. Er zijn verschillende methoden om EPF30,31,32 te isoleren, selecteren en identificeren. Bij het vergelijken van de verschillende soorten insectenaasmethoden werden Beauveria bassiana en Metarhizium anisopliae vaak aangetroffen in insectenaas6,12,13,14.</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
