Выделение и отбор энтомопатогенных грибов из образцов почвы и оценка грибковой вирулентности против насекомых-вредителей
Summary
Здесь мы представляем протокол, основанный на системе приманки мучного червя (Tenebrio molitor), которая использовалась для выделения и отбора энтомопатогенных грибов (EPF) из образцов почвы. Эффективная формула числа конидий (ECN) используется для выбора высокострессоустойчивого EPF на основе физиологических характеристик для борьбы с микробами вредителей в полевых условиях.
Abstract
Энтомопатогенные грибы (EPF) являются одним из микробных средств борьбы с вредителями. Для борьбы с местными или инвазивными вредителями важно изолировать и выбрать местные EPF. Поэтому метод почвенной приманки в сочетании с системой приманки для насекомых (мучный червь, Tenebrio molitor) был использован в данном исследовании с некоторыми модификациями. Затем изолированные EPF были подвергнуты тесту на вирулентность против сельскохозяйственного вредителя Spodoptera litura. Кроме того, потенциальные штаммы EPF подвергались морфологической и молекулярной идентификации. Кроме того, были проведены анализ производства конидий и термотолерантности для перспективных штаммов EPF и проведено сравнение; эти данные были далее заменены в формулу эффективного числа конидий (ECN) для лабораторного ранжирования. Система почвенных приманок-мучных червей и формула ECN могут быть улучшены путем замены видов насекомых и интеграции большего количества стрессовых факторов для оценки коммерциализации и применения в полевых условиях. Этот протокол обеспечивает быстрый и эффективный подход к выбору EPF и улучшит исследования агентов биологического контроля.
Introduction
В настоящее время энтомопатогенные грибы (EPF) широко используются в микробной борьбе с сельскохозяйственными, лесными и садоводческими вредителями. Преимуществами EPF являются его широкие диапазоны хозяев, хорошая приспособляемость к окружающей среде, экологичная природа и то, что он может использоваться с другими химическими веществами, чтобы показать синергетический эффект для комплексной борьбы с вредителями1,2. Для применения в качестве средства борьбы с вредителями необходимо выделить большое количество EPF либо от больных насекомых, либо от естественной среды.
Выборка этих организмов у их хозяев помогает понять географическое распределение и распространенность EPF у естественных хозяев3,4,5. Однако коллекция грибковых зараженных насекомых обычно ограничена факторами окружающей среды и популяциями насекомых в полевых условиях4. Учитывая, что насекомые-хозяева умирают после заражения EPF, а затем попадают в почву, выделение EPF из образцов почвы может быть стабильным ресурсом3,6. Например, известно, что сапрофиты используют мертвого хозяина в качестве своего ресурса для роста. Почвенные приманки и системы селективных сред широко используются для обнаружения и изоляции EPF из почвы3,4,7,8,9,10.
В методе селективной среды разбавленный почвенный раствор наносят на среду, содержащую антибиотики широкого спектра действия (например, левомицетин, тетрациклин или стрептомицин) для ингибирования роста бактерий2,3,9,11. Однако сообщалось, что этот метод может исказить разнообразие и плотность штамма и может привести к переоценке или недооценке многих микробных сообществ6. Более того, выделенные штаммы менее патогенны и конкурируют с сапрофитами при выделении. Трудно выделить EPF из разбавленного почвенного раствора3. Вместо использования селективной среды метод почвенной приманки изолирует EPF от зараженных мертвых насекомых, которые могут храниться в течение 2-3 недель, тем самым обеспечивая более эффективный и стандартный метод разделения EPF3,4,7,6. Поскольку метод прост в эксплуатации, можно выделить различные патогенные штаммы при низких затратах4. Поэтому он широко используется многими исследователями.
При сравнении различных типов систем приманки для насекомых, Beauveria bassiana и Metarhizium anisopliae являются наиболее распространенными видами EPF, которые встречаются у насекомых, принадлежащих к Hemiptera, Lepidoptera, Blattella и Coleoptera6,12,13,14. Среди этих насекомых-приманок Galleria mellonella (отряд Lepidoptera) и Tenebrio molitor (отряд Coleoptera) показывают более высокие показатели восстановления Beauveria и Metarhizium spp., если сравнивать с другими насекомыми. Поэтому G. mellonella и T. molitor обычно используются для травли насекомых. За эти годы Министерство сельского хозяйства США (USDA) создало библиотеку EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF), которая содержит широкий спектр видов, включая 4081 вид Beauveria spp., 18 видов Clonostachys spp., 878 видов Cordyceps spp., 2473 вида Metarhizium spp., 226 видов Purpureocillium spp., и 13 видов Pochonia spp. среди прочих15. Еще одна библиотека EPF была построена Исследовательской лабораторией энтомологии (ERL) из Университета Вермонта в Соединенных Штатах в течение 30 лет. Он включает в себя 1345 штаммов EPF из США, Европы, Азии, Африки и Ближнего Востока16.
Для борьбы с местными или инвазионными вредителями на Тайване требуется изоляция и отбор местных EPF. Поэтому в данном протоколе мы модифицировали и описали процедуру почвенного метода приманки и объединили ее с системой приманки для насекомых (мучный червь, Tenebrio molitor)17. На основе этого протокола была создана библиотека EPF. Для предварительных изолятов EPF было проведено два раунда скрининга (количественная оценка инокуляции). Изоляты EPF показали патогенность насекомых. Потенциальные штаммы подвергали морфологической и молекулярной идентификации и дополнительно анализировали термотолерантность и конидиальный производственный анализ. Кроме того, была также предложена концепция эффективного числа конидий (ECN). Используя формулу ECN и анализ главных компонентов (PCA), потенциальные штаммы были проанализированы под смоделированным давлением окружающей среды для завершения процесса создания и скрининга библиотеки EPF. Впоследствии патогенность перспективных штаммов EPF была проверена на целевом вредителе (например, Spodoptera litura). Текущий протокол интегрирует данные о термотолерантности и конидиальном производстве в формулу ECN и анализ PCA, которые могут использоваться в качестве стандартной системы ранжирования для исследований, связанных с EPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Энтомопатогенные грибы (EPF) использовались для борьбы с насекомыми. Существует несколько методов изоляции, выбора и идентификации EPF30,31,32. Сравнивая различные типы методов приманки для насекомых, Beauveria bassiana и Metarhizium anisopliae обычн…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом 109-2313-B-005 -048 -MY3 от Министерства науки и технологий (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
