रेडियोधर्मी सिग्नल की सेलुलर उत्पत्ति निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग-रेडियोलिगैंड उपचारित ऊतक (एफएसीएस-आरटीटी)
Summary
प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग-रेडियोलिगैंड उपचारित ऊतक (एफएसीएस-आरटीटी) सेलुलर पैमाने पर अल्जाइमर रोग में 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन या सेरोटोनिन 5 एचटी2 ए-रिसेप्टर अभिव्यक्ति की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह प्रोटोकॉल टीजीएफ 344-एडी चूहे मॉडल में एफएसीएस-आरटीटी के पूर्व-विवो आवेदन का वर्णन करता है।
Abstract
ग्लियल कोशिकाओं में संभवतः न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के पैथोफिजियोलॉजी में काफी निहितार्थ होता है, जैसे कि अल्जाइमर रोग (एडी)। उनके परिवर्तन शायद एक समर्थक भड़काऊ राज्य से जुड़े हुए हैं। टीजीएफ 344-एडी चूहे के तनाव को मानव एपीपी और मानव पीएस 1ई 9 जीन को व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो अमाइलॉइड प्रोटीन ए -40 और ए -42 के लिए एन्कोडिंग है और उम्र बढ़ने के साथ अमाइलॉइड विकृति और संज्ञानात्मक घाटे को प्रदर्शित करता है। टीजीएफ 344-एडी चूहे मॉडल का उपयोग इस अध्ययन में 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन (टीएसपीओ, ग्लियाल सेल सक्रियण का एक मार्कर) बाध्यकारी, और 5 एचटी2 ए-रिसेप्टर (5 एचटी 2एआर) सेरोटोनिन रिसेप्टर स्तर की सेलुलर उत्पत्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है जो संभवतः एडी में बाधित होते हैं। यहां प्रस्तुत तकनीक रेडियोलिगैंड ट्रीटेड टिशू (एफएसीएस-आरटीटी) के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग है, जो विवो पीईटी या एसपीईसीटी या पूर्व विवो / इन विट्रो ऑटोरेडियोग्राफी तकनीकों में पूरक एक मात्रात्मक सेल-प्रकार-विशिष्ट तकनीक है। यह साइटोमेट्री सेल सॉर्टिंग के बाद एक γ काउंटर का उपयोग करके इमेजिंग के लिए पहले इस्तेमाल किए गए एक ही रेडियोलेबल ट्रेसर को मापता है। यह उच्च सेलुलर विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ रेडियोलेबल प्रोटीन की सेलुलर उत्पत्ति का निर्धारण करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, एफएसीएस-आरटीटी के साथ अध्ययन से पता चला है कि (i) टीएसपीओ बाइंडिंग में वृद्धि लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) -प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन के चूहे मॉडल में माइक्रोग्लिया से जुड़ी हुई थी, (ii) 12- और 18-महीनों में टीएसपीओ बाइंडिंग में वृद्धि पहले एस्ट्रोसाइट्स से जुड़ी हुई थी, और फिर जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों की तुलना में टीजीएफ 344-एडी चूहों में माइक्रोग्लिया, और (iii) 5 एचटी2 ए के स्ट्रिएटल घनत्व एक ही चूहे एडी मॉडल में 18 महीने में एस्ट्रोसाइट्स में आर कम हो जाता है। दिलचस्प बात यह है कि इस तकनीक को लगभग सभी रेडियोट्रेसर्स तक बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, जैसे अल्जाइमर रोग (एडी), बढ़े हुए लक्षणों से जुड़े न्यूरोनल नुकसान की विशेषता है। एडी, मनोभ्रंश का सबसे आम कारण, 60% -70% मामलों में लेखांकन, दुनिया भर में लगभग 50 मिलियन लोगों को प्रभावित करताहै 1. एक न्यूरोपैथोलॉजिकल स्तर पर, एडी की दो प्रमुख विशेषताएं बाह्य अमाइलॉइड-β (ए) सजीले टुकड़े और इंट्रासेल्युलर ताऊ न्यूरोफिब्रिलरी टैंगल्स का संचय हैं। ग्लियल सेल परिवर्तन भी एडी2 और कई न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम 3,4 के संभावित व्यवधान के साथ जुड़े हुए हैं।
टीजीएफ 344-एडी चूहा लाइन को मानव एपीपी और पीएस 1ई 9 ट्रांसजेनेस को व्यक्त करके एडी मॉडल करने के लिए संशोधित किया गया है, जिससे घुलनशील और अघुलनशील ए -40 और ए -42 अभिव्यक्ति और अमाइलॉइड पट्टिका गठन5 हो जाता है। यह ताऊ प्रोटीन के हाइपरफॉस्फोरिलेटेड रूपों के संचय को भी प्रस्तुत करता है जो टौपैथी के लिए अग्रणी है। 9-24 महीने की उम्र से, चूहों ने उत्तरोत्तर एडी के पैथोलॉजिकल हॉलमार्क और एक संज्ञानात्मक हानि 5,6,7,8,9 विकसित की।
पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), एकल-फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (एसपीईसीटी), और ऑटोरेडियोग्राफी γ किरणों के उत्सर्जन और मात्रा का ठहराव के आधार पर तकनीकें हैं। रेडियोट्रेसर या तो विवो (पीईटी और एसपीईसीटी) या पूर्व विवो / इन विट्रो (ऑटोरेडियोग्राफी) में मात्रा निर्धारित किए जाते हैं। उन संवेदनशील तकनीकों ने एडी जैसे कई मस्तिष्क रोगों के तंत्र की समझ में योगदान दिया है। दरअसल, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के संदर्भ में, 18 केडीए ट्रांसलोकेटर प्रोटीन (टीएसपीओ) का आकलन करने वाले बहुत सारे अध्ययन हैं, जो एक इन विवो न्यूरोइन्फ्लेमेशन मार्कर है, जिसमें रेडियोलेबल ट्रेसर्स जैसे [11सी] – (आर) -पीके 111 9 5 या [11सी] पीबीआर 28 (समीक्षा के लिए10 देखें)। इसके अलावा, न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम के परिवर्तन ों का अध्ययन रेडियोट्रेसर 11,12,13 का उपयोग करके किया गया है।
हालांकि, वे तकनीकें रेडियोधर्मी संकेत की सेलुलर उत्पत्ति को निर्धारित नहीं करती हैं। यह पीईटी / एसपीईसीटी में रेडियोलिगैंड के बंधन में परिवर्तन के जैविक आधार की व्याख्या में बाधा डाल सकता है। उदाहरण के लिए, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के टीएसपीओ अध्ययनों के मामले में, यह समझना कि क्या टीएसपीओ की वृद्धि या कमी एस्ट्रोसाइटिक या माइक्रोग्लियल परिवर्तनों के कारण है, सर्वोपरि महत्व का है। रेडियोलिगैंड उपचारित ऊतक (एफएसीएस-आरटीटी) तकनीक के लिए प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग इन समस्याओं को प्राप्त करने के लिए विकसित की गई थी, जिससे प्रत्येक सेल प्रकार में रेडियोलिगैंड बाइंडिंग का मूल्यांकन अलग से किया जा सकता है और प्रति सेल लक्ष्य-प्रोटीन घनत्व का ठहराव होता है। यह अभिनव तकनीक परिणामस्वरूप पूरक और पीईटी और स्पेक्ट इमेजिंग के साथ अत्यधिक संगत है।
यहां, इस तकनीक को दो अक्षों के साथ लागू किया गया था: टीएसपीओ-विशिष्ट रेडियोलिगैंड्स का उपयोग करके न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन और सेरोटोनर्जिक सिस्टम का आकलन करना। पहली धुरी पर, उद्देश्य एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया के जवाब में टीएसपीओ सिग्नल की सेलुलर उत्पत्ति को समझना था। इसलिए, एफएसीएस-आरटीटी का उपयोग चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों पर एक लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) इंजेक्शन के माध्यम से न्यूरोइन्फ्लेमेशन के प्रेरण के बाद और विवो [125आई] क्लिंडे स्पेक्ट इमेजिंग अध्ययन के बाद किया गया था। इसके अलावा, एक ही इमेजिंग और एफएसीएस-आरटीटी प्रोटोकॉल 12- और 24 महीने के टीजीएफ 344-एडी चूहों और जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों से मेल खाने पर लागू किए गए थे। दूसरी धुरी का उद्देश्य सेल प्रकार द्वारा पूर्व विवो 5-एचटी 2 ए आर घनत्व मूल्यांकन के माध्यम से इस चूहे मॉडल में सेरोटोनिनर्जिक सिस्टमपरिवर्तनोंकी उत्पत्ति निर्धारित करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे ज्ञान के लिए, यह तकनीक एक दृष्टिकोण का वर्णन करने वाली पहली थी जो सेलुलर स्तर पर एक रेडियोट्रेसर के विवो बाध्यकारी परिवर्तनों में बेहतर समझ की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल उदाहरण के रूप में [125 आई]…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 320030-184713) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक बीबीटी और केसी को वेलक्स फाउंडेशन (परियोजना एन 1123) द्वारा समर्थित किया जाता है। लेखक एसटी को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अर्ली पोस्ट-डॉक मोबिलिटी स्कॉलरशिप, नं। P2GEP3_191446), प्रोफेसर डॉ मैक्स क्लोएटा फाउंडेशन (क्लिनिकल मेडिसिन प्लस छात्रवृत्ति), और जीन और मैडेलीन वाचोक्स फाउंडेशन।
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
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