Her præsenterer vi en pipeline til 3D-korrelativfokuseret ionstrålefræsning til styring af forberedelsen af cellulære prøver til kryo-elektrontomografi. 3D-positionen af fluorescerende mærkede proteiner af interesse bestemmes først ved kryofluorescensmikroskopi og målrettes derefter til fræsning. Protokollen er velegnet til pattedyr, gær og bakterieceller.
Kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er blevet den valgte metode til undersøgelse af cellulære ultrastruktur og molekylære komplekser i deres oprindelige, frosne hydratiserede tilstand. Kryo-ET kræver dog, at prøverne er tynde nok til ikke at sprede eller blokere den indfaldende elektronstråle. For tykke cellulære prøver kan dette opnås ved kryofokuseret ionstrålefræsning (FIB). Denne protokol beskriver, hvordan man målretter mod specifikke cellulære steder under FIB-fræsning ved hjælp af en 3D-korrelativ tilgang, der kombinerer tredimensionelle fluorescensmikroskopidata med information fra FIB-scanningelektronmikroskopet. Ved hjælp af denne teknik kan sjældne cellulære begivenheder og strukturer målrettes med høj nøjagtighed og visualiseres ved molekylær opløsning ved hjælp af kryotransmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM).
Fokuseret ionstrålefræsning muliggør forberedelse af tynde biologiske prøver fra kryofikserede prøver uden de problemer, der ofte er forbundet med mekaniske sektioner såsom knivmærker og kompressionsartefakter1. Når FIB-fræsning parres med kryo-elektrontomografi, muliggør FIB-fræsning biologiske undersøgelser med høj opløsning af den cellulære morfologi og bestemmelse af strukturen af makromolekylære komplekser direkte inde fra celler ved subnanometeropløsning 2,3,4. Mens rigelige arter, såsom ribosomer, let findes i tilfældigt skårne FIB-lameller, er mange cellulære processer afhængige af colokalisering af flere komplekser eller er lokaliseret til bestemte steder i cellen. Derfor kræves effektiv målretning for ikke at miste det biologiske træk af interesse under fræseprocessen og være begrænset til tilfældige hits. En korrelativ tilgang, der kombinerer data fra scanningelektronmikroskopet (SEM)-FIB og et kryofluorescenslysmikroskop (FLM), er derfor nødvendig. Selvom det er muligt at udelade den oprindelige korrelation og først kombinere FLM- og kryo-ET-data efter TEM-erhvervelse5,6, muliggør fluorescensstyret fokuseret ionstrålefræsning en nøjagtig udvælgelse af fræseområdet på forhånd, hvilket resulterer i mere effektiv dataindsamling. Siden sin undfangelse7 havde anvendelsen af 3D-korreleret FIB-fræsning i biologiske undersøgelser været begrænset, indtil vi for nylig rapporterede at identificere et nyt væske-væskefase-adskilt (LLPS) rum i gær ved hjælp af denne teknik8.
Her beskrives en generaliseret 3D-kryo-korreleret lys- og elektronmikroskopi (CLEM) protokol, som kan bruges til at studere en bred vifte af prøver lige fra bakterier til gær- og pattedyrceller. Mens eksperimenterne blev udført ved hjælp af et bestemt sæt instrumenter, er de enkelte trin ikke bundet til specifik hardware og kan let overføres til andre systemer som en udvidelse til eksisterende protokoller 3,5. En liste over testet udstyr og foreslåede indstillinger findes i materialetabellen og tabel 1. De fire vigtigste trin i rørledningen er (1) prøveforberedelse, (2) lokalisering af funktioner af interesse ved kryofluorescensmikroskopi, (3) 3D-korreleret fokuseret ionstrålefræsning og (4) lokalisering af de målrettede strukturer til kryo-ET-dataindsamling på lamellerne i kryotransmissionselektronmikroskopet (figur 1).
1. Kritiske trin i protokollen
Optimering af cellekultur og gitterdykkende parametre er grundlæggende for denne arbejdsgang. I begyndelsen af et projekt er det værd at investere tid i at optimere taggingstrategier, fordelingen af celler og fiduciale perler og teste forskellige gitterforberedelses- og blottingparametre. Arbejde med en optimalt dykfrosset prøve vil betydeligt lette downstream-behandlingen.
Som for ethvert TEM-eksperiment kræves glasagtige prøver. For store pattedyrceller som HeLa foretrækkes 1-2 celler pr. gitterkvadrat, men celler kan stadig være glasagtige ved højere densitet. Eventuelt kan vitrifikation forbedres i pattedyrceller (f.eks. HEK293, HeLa) ved at inkubere dem med 2,5-10% (v / v) glycerol tilsat til dyrkningsmediet 10 minutter, før de falder23. Hvis det er muligt, kan gittermønstre bruges til at sikre perfekt placering og fordeling af cellerne og derved forbedre vitrifikation og senere korrelation24.
Mens specifikke celler kan vælges under arbejdsgangen, vil for få celler, der viser det biologiske træk af interesse, reducere den samlede gennemstrømning betydeligt. For at forbedre korrelationen i POI-positive celler bør der anvendes tilstrækkeligt lyse fluoroforer. Dette er især vigtigt på endogene ekspressionsniveauer. Vi fandt ud af, at mVenus under kryo-forhold ofte klarede sig bedre end EGFP på grund af dens øgede lysstyrke25 og det hypsokromiske skift, hvilket holder den velegnet til standard GFP-filteropsætninger under kryo-forhold26. For ikke-punktlignende målstrukturer bør afvejningen mellem bølgelængde og lokaliseringsnøjagtighed (Abbe-diffraktionsgrænse) også overvejes.
Effektiv 3D-korrelation kræver også, at elnettet er mekanisk stabilt og håndteres med stor omhu. Mens standard guld- eller kobbergitter med kulstofstøtte kan anvendes, kan succesraten øges betydeligt ved at bruge mere stive SiO2-film afhængigt af projektet. Det er dog endnu ikke endeligt bestemt, om (a) mekanisk stabilitet eller (b) matchende termiske ekspansionskoefficienter (substrat vs. film) for at reducere kryorynker27 er den mest afgørende faktor for vellykket 3D-korrelation. Desuden kan der anvendes polydimethylsiloxanovertrukne skåle til opsamling af skrøbelige Au-riste5.
Ud over at sikre prøvestabilitet er et omhyggeligt valg af FLM-billeddannelsesparametre nødvendigt for at opnå fluorescensstakke af høj kvalitet, der er egnede til optimal målretning under FIB-fræsning. I denne henseende anbefales det også at teste forskellige denoising28 eller dekonvolutionsteknikker på FLM-dataene, da det kan forbedre lokaliseringen af fiducials og cellulære signaler betydeligt. Når fluorescenssignalet korreleres til FIB-SEM-billeder, er en god prøveudtagning af fiduciale perler vigtig. De skal være godt fordelt omkring cellerne og muligvis i forskellige z-højder. Det er også god praksis at validere konsistensen af korrelationen ved at kontrollere de forudsagte vs. faktiske positioner af perler, der bevidst blev udeladt af fiducialmodellen, men klart kan korreleres med øjet. 3DCTs RMSE-værdier bør også altid tages i betragtning for at kontrollere registreringskonsistensen.
Da aflejring af formalet materiale og restvand fra FIB-SEM-kammeret (dvs. rekontaminering) øger den effektive lameltykkelse ved at tilføje amorft materiale til begge sider af det, reducerer opbevaring af finmalede lameller i mikroskopet i længere tid generelt TEM-datakvaliteten på grund af yderligere elektronspredningshændelser. Derfor udføres fræsning oftest i to trin: Først fræses alle positioner groft (dvs. til ca. 800 nm) og derefter fint (til ~ 150-250 nm), og gitteret aflæses straks, efter at den sidste lamel er afsluttet. Bedre korrelationssucces kan dog opnås ved at behandle de interessante positioner på en stedlig måde og dermed udføre grov og fin fræsning på de samme lameller direkte efter hinanden, da dette ikke giver tid til bøjning eller deformation. Dette reducerer dog det maksimale antal lameller, der kan produceres pr. gitter, afhængigt af systemets rekontamineringshastighed. For en hastighed på 20 nm / h produceres 4-6 lameller inden for 1-1,5 timer.
Bevægelse af hele gitteret eller de grovfræsede lameller >300 nm vil resultere i dårlig eller mislykket korrelation (se også begrænsninger, der diskuteres nedenfor). Det bør derfor kontrolleres regelmæssigt, f.eks. ved at sammenligne IB-billeder før, under og efter FIB-fræsning. Steder, der viser betydelig bevægelse (>300 nm), skal kasseres. Optimer prøveforberedelsen (dvs. valg af gittertype, celletæthed og dykparametre; se protokolafsnit 1) og fræsningsstrategi for at undgå disse bevægelser. Lamelbøjning kan reduceres betydeligt ved fræsning på stedet som beskrevet i trin 3.6 og reduktion af lamelbredden. Som tidligere nævnt, mens stressaflastningssnit15 er designet til at reducere lamelbøjning, resulterer de ofte i en samordnet bevægelse af den afkoblede lamel og derved effektivt forhindrer korrelation. Integrerede FLM-systemer kan bruges til at løse dette problem.
2. Ændringer og fejlfinding af metoden
Det anbefales stærkt at udføre en grundig karakterisering af prøven i levende cellebilleddannelse, før du går til kryo-betingelser. Optimering af celleprøver, behandlingsordninger og viden om, hvilken slags signal man kan forvente, før man går ind i cryo-workflowet, kan forbedre succesraten betydeligt.
I arbejdsgangen, der præsenteres her, bruges et enkeltstående fluorescensmikroskop med et kryo-trin til at afbilde prøverne efterfulgt af en overførsel af gitterene til det fokuserede ionstrålemikroskop. Det er imidlertid blevet testet på systemer, hvor et fluorescensmikroskop er integreret i FIB-SEM-kammeret, og derfor kræves der ingen prøveoverførsel for at erhverve fluorescensbilleder 29,30,31. Ved hjælp af sådanne integrerede systemer kan interessepositioner afbildes under og efter FIB-fræsning for at kontrollere tilstedeværelsen af målfluorescenssignalet uden at øge risikoen for kontaminering af de endelige lameller. Det er dog vigtigt at huske de optiske parametre for de anvendte mikroskoper, da f.eks. et lavt NA-mål vil begrænse den præcision, hvormed fiduciale perler og målsignaler kan lokaliseres. Ikke desto mindre vil integrerede FLM-opsætninger også hjælpe med bedre at håndtere små deformationer af net og lameller, da FLM-stakke løbende kan opdateres og sammenlignes med opdaterede SEM- og IB-visninger.
Som et alternativ til fluorescensbilleddannelse af lamellen mellem FIB-fræsning og TEM-dataindsamling kan post-TEM-korrelation bruges til at verificere korrekt placering og fræsning af lamellerne 5,6.
Under alle trin i den korrelative arbejdsgang, men især under TEM, anbefales det at oprette en overlejring af de projicerede fluorescensdata på FIB-SEM/TEM-billederne. Sådanne klassiske CLEM-synspunkter hjælper med at forstå mere intuitivt, hvilken del af cellerne der er indeholdt i lamellerne. Dette tjener også som en nyttig sanity check for at verificere nøjagtigheden af korrelationen.
3. Metodens begrænsninger
Den 3D-korrelerede FIB-tilgang kræver prøver, der kan leveres med fiduciale perler. Derfor er denne metode i øjeblikket begrænset til dykfrosne gitre. For højtryksfrosne (HPF) (væv) prøver kan der i øjeblikket kun udføres 2D-2D-korrelationer. Potentielt kan interne fiduciale markører (f.eks. Organeller, farvede lipiddråber) være en løsning på dette problem32,33. Den endelige korrelationssuccesrate afhænger af mange faktorer, herunder prøvekvaliteten, fluorescensmikroskopiopsætningen, lameltykkelsen og størrelsen af den målrettede struktur. Korrelationsnøjagtigheden ved hjælp af den beskrevne 3D-registreringsmetode anslås at ligge i området 200-300 nm på det endelige IB-billede, hvilket stort set svarer til den typiske tykkelse af FIB-fræsede lameller7. Derfor vil cellulære strukturer, der er meget mindre end dette, være svære at målrette mod i øjeblikket. Derudover reducerer overdreven bevægelse på fræsestedet (>300 nm) også nøjagtigheden af korrelationen, et problem, der potentielt kan løses med FLM-opsætninger integreret i FIB/SEM-instrumenter. Lameller, der udviser stærk deformation eller bøjning under fræsning, bør under alle omstændigheder udelukkes fra downstream-arbejdsgangen.
Samlet set er kryofluorescensbilleddannelse i øjeblikket begrænset af Abbe-diffraktionskriteriet. Med mere rutinemæssig anvendelse (og kommercialisering) af superopløste cryo-FLM-metoder kan mere nøjagtig målretning af cellulære strukturer blive mulig, især når den integreres i FIB / SEM til on-the-fly drift.
4. Metodens betydning
Især sammenlignet med ikke-målrettede og postkorrelationsteknikker gør den 3D-korrelerede FIB-fræsningsmetode det muligt at vælge passende positioner før det tids- og ressourcekrævende TEM-trin. Det muliggør dermed mere effektiv dataindsamling og projektplanlægning. Desuden tilføjer de korrelerede fluorescensdata et lag af information, der kan være afgørende for fortolkningen af tomogrammerne og for at integrere cryo-ET-resultaterne i projekter i flere skalaer, især når det drejer sig om ikke-strukturerede proteinsamlinger eller dem, der er for små til skabelonmatchning og subtomogramgennemsnit.
5. Betydning og potentielle fremtidige anvendelser
I kombination med avancerede arbejdsgange såsom kryoløft ud af HPF-prøver 34,35, kryo-FIB-SEM volumen 36 og superopløsningsfluorescensbilleddannelse26,37,38,39 giver 3D-målrettet lamelpræparation udsigt til ikke kun at dissekere biologiske processer i isolerede celler, men også at gøre vævs- og patientprøver tilgængelige for FIB-fræsning og kryo-elektrontomografi. Som sådan vil det muliggøre dissektion af patologiske processer i høj opløsning og dermed være en integreret byggesten mod en biopsi på nanoskala.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Inga Wolf for at understøtte IT-infrastrukturen, Florian Beck for beregningsstøtte og Oda H. Schiøtz for den kritiske læsning af manuskriptet. Finansieringen blev delvist ydet gennem et Alexander von Humboldt returners stipendium til Philipp S. Erdmann og et EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 til Florian Wilfling. Anna Bieber blev støttet af et Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. stipendium.
Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |