嚢胞性線維症気道マイクロバイオームに対する酸素付加の効果を研究するモデルの設計と開発
Summary
このプロトコルの目的は、嚢胞性線維症の気道微生物群集に対する高酸素の効果に対するモデルシステムを開発することです。 人工喀痰培地は痰の組成をエミュレートし、高酸素培養条件は肺微生物群集に対する補足的な酸素の影響をモデル化する。
Abstract
気道微生物群集は、嚢胞性線維症(CF)および他の慢性肺疾患の進行に重要な役割を果たすと考えられている。微生物は、伝統的に酸素を使用または許容する能力に基づいて分類されてきました。補足酸素は嚢胞性線維症(pwCF)を持つ人々に投与される一般的な医療療法である;しかし、酸素と気道マイクロバイオームに関する既存の研究は、高酸素(高酸素)ではなく低酸素(低酸素)が主に好気性および栄養性嫌気性肺微生物群集に及ぼす影響に焦点を当てている。この重要な知識のギャップに対処するために、このプロトコルはpwCFからの痰の組成を模倣する人工痰媒体を使用して開発された。透明な媒体をもたらすフィルター殺菌の使用は、光学的方法が懸濁培養中の単細胞の微生物の成長に従うことを可能にする。高酸素状態を作り出すために、このモデルシステムは、高酸素状態を研究するために確立された嫌気性培養技術を利用する;酸素を除去する代わりに、酸素は、圧縮された酸素と空気の混合物と血清ボトルの毎日のスパージングによって培養物に追加されます。50 pwCFの痰は、このモデルが微分酸素状態を維持する能力を検証するために、72時間の間毎日のスペアリングを受けました。ショットガンメタゲノムシーケンシングは、嚢胞性線維症痰に一般的に見られる昏睡および病原性微生物の増殖をサポートするこの培地の能力を検証するために、11 pwCFの培養および未培養痰サンプルに対して行われた。成長曲線は、一般的な嚢胞性線維症病原体の増殖をサポートするこの人工痰培地の能力を検証するためにpwCFから得られた112の分離株から得られた。このモデルは、CF痰中の多種多様な病原体および分性を培養し、ノルモキシ状態下で未培養痰に非常に類似したコミュニティを回収し、様々な酸素条件下で異なる培養機種を作り出すことを発見した。この新しいアプローチは、気道微生物群集および一般的な呼吸器病原体にpwCFの酸素の使用によって誘発される予期せぬ影響のより良い理解につながる可能性があります。
Introduction
嚢胞性線維症(CF)は、肺から厚い粘液を取り除くことができないことを特徴とする遺伝性疾患であり、繰り返し感染し、肺移植または死亡の必要性を引き起こす進行性肺機能の低下につながる。嚢胞性線維症(pwCF)を有する人々の気道マイクロバイオームは、疾患活性1を追跡するように見えるが、有害な長期的な結果2、3に関連する微生物多様性の減少を伴う。pwCFの臨床研究では、補足的な酸素療法は、より高度な疾患4、5と関連しているが、伝統的に、酸素療法の使用は、単に疾患の重症度のマーカーとして見られてきた6。呼吸器不全患者の臨床試験の最近の研究では、患者の酸素レベルが高いほど、重篤な細菌感染の増加と死亡率の上昇に逆説的に関連することが示されており、補足的な酸素が病原発に寄与する可能性があることが示唆されている。嚢胞性線維症肺マイクロバイオームおよび関連する肺および気道微生物群集に対する補足酸素の影響は十分に研究されていない。
多くの場合、機械学的研究は、未知の医学的利益または害の介入に関連する物流上の困難および潜在的な倫理的問題のために、人間の被験者に直接行うことができない。ヒトの生体標本をモデルシステムに統合するトランスレーショナルアプローチは、これらの場合に重要な生物学的洞察を提供することができる。酸素を使用または許容する能力は、伝統的に微生物分類の重要な構成要素であったが、環境への補足酸素の治療的導入が気道微生物群集をどのように摂動させるかについてはほとんど知られていない。pwCFの気道マイクロバイオームに対する補助酸素の未知の影響に光を当てるには、2つの大きな課題に取り組む必要がありました。まず、CF痰の組成を生理学的に近似する培養培地の作成。第二に、培養中の酸素濃度の上昇を長期間にわたって維持できるモデルシステムの作成である。
人工喀痰培地(ASM)は肺痰ex vivo8,9,10をエミュレートするために広く使用されていますが、特定のレシピに関する明確なコンセンサスはありません。このプロトコルは、pwCFから生理学的に近似的な痰に設計された人工痰培地のレシピと準備戦略を記述する。表 1に、公開された文献に基づいて選択したレシピ値の概要を示します。基礎化学成分およびpHは、ヒトCF痰11、12、13の研究によって同定された値に一致した。低濃度の生理学的栄養素を、最終体積10の0.25%として含まれていた卵黄、ならびにビタミンおよび微量金属混合14、15を用いて添加した。痰16の主要成分であるムチンは、1%w/v14に含まれていた。より労働集約的であるが、必須培地成分10の熱誘発性変性による潜在的な問題を低減するために、より従来の熱滅菌の実施よりもフィルタ滅菌が選択された。フィルター滅菌の追加の利点は、透明な媒体を生成することです(熱殺菌は、塩やタンパク質の沈殿と凝固に起因する濁った媒体を作成することができます)、この人工痰培地は、濁度の増加に基づいて微生物の成長に従うために使用することができます。
この高酸素培養モデルは、酸素を除去するのではなく、酸素を添加する嫌気性培養技術に基づいており、pwCFの酸素補充使用の効果を示すモデルを作成する。 図1 と関連する酸素スペアリングプロトコルは、一般の実験室および病院のサプライヤーから低コストで得ることができる酸素スペアリングシステムの成分を概説しています。このシステムは21%から100%の酸素の範囲の固定された濃度に圧縮された酸素および空気の混合を可能にする。酸素センサーの統合は出力ガス混合物の集中の確認、ならびに酸素状態が所望の範囲内で維持されていることを確認するために前にスパージされた血清びんの流出ガスの組成を確認することを可能にする。
このプロトコルは、人工痰培地を作成する手順、酸素スペアリングシステムの構築と使用、および微分酸素条件下での培養CF痰への両方の適用を概説する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、肺微生物群集に対する高酸素の影響を研究するために 、in vitro モデルが開発された。このモデルは、人工喀痰媒質および血清瓶の毎日のスパージングに基づいて、上昇した酸素濃度を維持し、pwCFから痰で同定された微生物の成長をサポートする。
このアプローチには、いくつかの重要なステップがあります。まず、人工痰培地の熱殺菌ではなく、フ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業の一部は、海洋生物学研究所、DOE(DE-SC0016127)、NSF(MCB1822263)、HHMI(助成金番号5600373)、サイモンズ財団からの贈り物の支援を受けて海洋生物学研究所で行われました。
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
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