Ontwerp en ontwikkeling van een model om het effect van aanvullende zuurstof op het cystische fibrose-luchtwegmicrobioom te bestuderen
Summary
Het doel van dit protocol is om een modelsysteem te ontwikkelen voor het effect van hyperoxie op cystic fibrosis airway microbial communities. Kunstmatig sputummedium emuleert de samenstelling van sputum en hyperoxische cultuuromstandigheden modelleren de effecten van aanvullende zuurstof op microbiële longgemeenschappen.
Abstract
Van microbiële gemeenschappen in de luchtwegen wordt gedacht dat ze een belangrijke rol spelen bij de progressie van cystische fibrose (CF) en andere chronische longziekten. Microben zijn van oudsher geclassificeerd op basis van hun vermogen om zuurstof te gebruiken of te verdragen. Aanvullende zuurstof is een veel voorkomende medische therapie die wordt toegediend aan mensen met cystische fibrose (pwCF); bestaande studies over zuurstof en het luchtwegmicrobioom hebben zich echter gericht op hoe hypoxie (lage zuurstof) in plaats van hyperoxie (hoge zuurstof) de overwegend aerobe en facultatieve anaerobe microbiële longgemeenschappen beïnvloedt. Om deze kritieke kenniskloof aan te pakken, is dit protocol ontwikkeld met behulp van een kunstmatig sputummedium dat de samenstelling van sputum van pwCF nabootst. Het gebruik van filtersterilisatie, dat een transparant medium oplevert, maakt optische methoden mogelijk om de groei van eencellige microben in suspensieculturen te volgen. Om hyperoxische omstandigheden te creëren, maakt dit modelsysteem gebruik van gevestigde anaerobe kweektechnieken om hyperoxische omstandigheden te bestuderen; in plaats van zuurstof te verwijderen, wordt zuurstof aan culturen toegevoegd door dagelijks serumflessen te sparen met een mengsel van gecomprimeerde zuurstof en lucht. Sputum van 50 pwCF onderging dagelijks sparen gedurende een periode van 72 uur om het vermogen van dit model om differentiële zuurstofcondities te handhaven te verifiëren. Shotgun metagenomische sequencing werd uitgevoerd op gekweekte en niet-gekweekte sputummonsters van 11 pwCF om het vermogen van dit medium te verifiëren om de groei van commensale en pathogene microben te ondersteunen die vaak worden aangetroffen in cystic fibrosis sputum. Groeicurven werden verkregen uit 112 isolaten verkregen van pwCF om het vermogen van dit kunstmatige sputummedium te verifiëren om de groei van veel voorkomende cystische fibrose pathogenen te ondersteunen. We vinden dat dit model een breed scala aan pathogenen en commensalen in CF-sputum kan kweken, een gemeenschap herstelt die sterk lijkt op ongecultiveerd sputum onder normoxische omstandigheden en verschillende kweekfenotypen creëert onder verschillende zuurstofomstandigheden. Deze nieuwe aanpak kan leiden tot een beter begrip van onverwachte effecten veroorzaakt door het gebruik van zuurstof in pwCF op microbiële gemeenschappen in de luchtwegen en veel voorkomende respiratoire pathogenen.
Introduction
Cystic fibrosis (CF) is een genetische ziekte die wordt gekenmerkt door een onvermogen om dik slijm uit de longen te verwijderen, wat leidt tot herhaalde infecties en progressieve achteruitgang van de longfunctie die vaak resulteert in de noodzaak van longtransplantatie of de dood. Het luchtwegmicrobioom van mensen met cystische fibrose (pwCF) lijkt de ziekteactiviteit te volgen1, met een vermindering van microbiële diversiteit geassocieerd met nadelige langetermijnresultaten2,3. In klinische studies van pwCF is aanvullende zuurstoftherapie in verband gebracht met meer geavanceerde ziekte4,5, hoewel traditioneel het gebruik van zuurstoftherapie wordt gezien als eenvoudigweg een marker voor de ernst van de ziekte6. Recente studies van een klinische studie van patiënten met respiratoire insufficiëntie hebben aangetoond dat hogere zuurstofniveaus van patiënten paradoxaal genoeg geassocieerd zijn met een toename van ernstige bacteriële infecties en hogere mortaliteit7, wat suggereert dat aanvullende zuurstof kan bijdragen aan de pathogenese van de ziekte. Het effect van aanvullende zuurstof op het cystic fibrosis longmicrobioom en de bijbehorende long- en luchtwegmicrobiële gemeenschappen is niet goed bestudeerd.
Mechanistische studies kunnen vaak niet rechtstreeks op menselijke proefpersonen worden uitgevoerd vanwege logistieke problemen en mogelijke ethische problemen in verband met interventies met onbekend medisch voordeel of schade. Translationele benaderingen die menselijke biospecimens integreren in modelsystemen kunnen in deze gevallen belangrijke biologische inzichten bieden. Hoewel het vermogen om zuurstof te gebruiken of te verdragen van oudsher een belangrijk onderdeel is van microbiële classificatie, is er weinig bekend over hoe de therapeutische introductie van aanvullende zuurstof in het milieu microbiële gemeenschappen in de luchtwegen zou kunnen verstoren. Om licht te werpen op de onbekende effecten van extra zuurstof op de luchtwegmicrobiomen van pwCF, moesten we twee grote uitdagingen aanpakken; ten eerste, de creatie van een kweekmedium dat fysiologisch de samenstelling van CF-sputum benadert; ten tweede, de creatie van een modelsysteem dat het mogelijk maakt om gedurende langere tijd verhoogde zuurstofconcentraties in cultuur te behouden.
Kunstmatige sputummedia (ASM) worden veel gebruikt om longsputum ex vivo8,9,10na te bootsen, maar er is geen duidelijke consensus over een specifiek recept. Dit protocol beschrijft een recept en bereidingsstrategie voor kunstmatig sputummedium, zorgvuldig ontworpen om sputum van pwCF fysiologisch te benaderen. Tabel 1 geeft een overzicht van de gekozen receptwaarden op basis van gepubliceerde literatuur. Chemische basiscomponenten en pH werden gematcht met waarden geïdentificeerd door studies van menselijk CF-sputum11,12,13. Fysiologische voedingsstoffen met een lage concentratie werden toegevoegd met behulp van eigeel, dat werd opgenomen als 0,25% van het uiteindelijke volume10, evenals vitamine- en sporenmetaalmengsels14,15. Mucine, het belangrijkste bestanddeel van sputum16, werd opgenomen bij 1% w / v14. Hoewel arbeidsintensiever, werd filtersterilisatie gekozen boven de meer conventionele praktijk van warmtesterilisatie om potentiële problemen door warmte-geïnduceerde denaturatie van essentiële mediacomponenten te verminderen10. Een bijkomend voordeel van filtersterilisatie is dat het media genereert die transparant zijn (warmtesterilisatie kan troebele media creëren als gevolg van precipitatie en coagulatie van zouten en eiwitten), waardoor dit kunstmatige sputummedium kan worden gebruikt om microbiële groei te volgen op basis van toename van troebelheid.
Dit modelsysteem voor de hyperoxische cultuur is gebaseerd op anaerobe kweektechnieken waarbij zuurstof wordt toegevoegd in plaats van verwijderd, waardoor een model ontstaat voor het effect van aanvullend zuurstofgebruik voor pwCF. Figuur 1 en het bijbehorende zuurstofsparende protocol schetst de componenten van een zuurstofspaarsysteem, dat tegen lage kosten kan worden verkregen bij leveranciers van algemene laboratoria en ziekenhuizen. Dit systeem maakt het mengen van gecomprimeerde zuurstof en lucht tot vaste concentraties variërend van 21% -100% zuurstof mogelijk. De integratie van een zuurstofsensor maakt het mogelijk om de concentratie van het uitgaande gasmengsel te verifiëren en de uitstroomgassamenstelling van eerder gespargeerde serumflessen te controleren om te controleren of de zuurstofcondities binnen het gewenste bereik zijn gehouden.
Dit protocol schetst procedures voor het creëren van een kunstmatig sputummedium, de constructie en het gebruik van een zuurstofspaarsysteem en de toepassing van beide om CF-sputum te kweken onder differentiële zuurstofomstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie werd een in vitro model ontwikkeld om het effect van hyperoxie op microbiële longgemeenschappen te bestuderen. Dit model, gebaseerd op kunstmatig sputummedium en dagelijks sparen van serumflessen, handhaaft verhoogde zuurstofconcentraties en ondersteunt de groei van microben geïdentificeerd in sputum van pwCF.
Er zijn verschillende kritische stappen van deze aanpak. Ten eerste is de keuze om filtersterilisatie te gebruiken in plaats van warmtesterilisatie van het kuns…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Een deel van dit werk werd uitgevoerd in het Marine Biological Lab met steun van het Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (subsidienummer 5600373) en een gift van de Simons Foundation.
Materials
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model – An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , (2010).
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Médecine. 96 (47), 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta’omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
