Design och utveckling av en modell för att studera effekten av extra syre på cystisk fibros luftvägsmikrobiomet

Summary

Målet med detta protokoll är att utveckla ett modellsystem för effekten av hyperoxia på cystisk fibros luftvägarna mikrobiella samhällen. Konstgjorda sputum medium efterliknar sammansättningen av sputum, och hyperoxic kultur villkor modellera effekterna av kompletterande syre på lung mikrobiella samhällen.

Abstract

Luftvägarna mikrobiella samhällen tros spela en viktig roll i utvecklingen av cystisk fibros (CF) och andra kroniska lungsjukdomar. Mikrober har traditionellt klassificerats baserat på deras förmåga att använda eller tolerera syre. Extra syre är en vanlig medicinsk terapi som ges till personer med cystisk fibros (pwCF); Befintliga studier på syre och luftvägsmikrobiomet har dock fokuserat på hur hypoxi (lågt syre) snarare än hyperoxi (högt syre) påverkar de övervägande aeroba och fakultetsmässiga anaeroba lungmikrobiella samhällena. För att ta itu med denna kritiska kunskapslucka utvecklades detta protokoll med hjälp av ett artificiellt sputum medium som efterliknar sammansättningen av sputum från pwCF. Användningen av filtersterilisering, som ger ett transparent medium, gör det möjligt för optiska metoder att följa tillväxten av encelliga mikrober i suspensionskulturer. För att skapa hyperoxiska förhållanden utnyttjar detta modellsystem etablerade anaeroba odlingstekniker för att studera hyperoxiska förhållanden; Istället för att avlägsna syre tillsätts syre till kulturer genom daglig sparning av serumflaskor med en blandning av komprimerat syre och luft. Sputum från 50 pwCF genomgick daglig sparging under en 72-h period för att verifiera förmågan hos denna modell att upprätthålla differentiella syreförhållanden. Hagelgevär metagenomisk sekvensering utfördes på odlade och uncultured sputum prover från 11 pwCF att verifiera förmågan hos detta medium att stödja tillväxten av commensal och patogena mikrober som ofta finns i cystisk fibros sputum. Tillväxt kurvor erhölls från 112 isolat erhålls från pwCF att verifiera förmågan hos detta konstgjorda sputum medium att stödja tillväxten av gemensamma cystisk fibros patogener. Vi finner att denna modell kan odla en mängd olika patogener och commensals i CF sputum, återhämtar ett samhälle som mycket liknar uncultured sputum under normoxic villkor, och skapar olika kultur fenotyper under varierande syre villkor. Detta nya tillvägagångssätt kan leda till en bättre förståelse av oförutsedda effekter som orsakas av användning av syre i pwCF på luftvägarna mikrobiella samhällen och gemensamma luftvägarna patogener.

Introduction

Cystisk fibros (CF) är en genetisk sjukdom som kännetecknas av en oförmåga att rensa tjock slem från lungorna, vilket leder till upprepade infektioner och progressiv lungfunktionsnedgång som ofta resulterar i behovet av lungtransplantation eller död. Luftvägsmikrobiomet hos personer med cystisk fibros (pwCF) verkar spåra sjukdomsaktivitet¹, med en minskning av mikrobiell mångfald i samband med negativa långsiktiga resultat^2,3. I kliniska studier av pwCF har kompletterande syreterapi associerats med mer avancerad sjukdom^4,5, men traditionellt har användningen av syreterapi setts som helt enkelt en markör för sjukdomens svårighetsgrad⁶. Nyligen genomförda studier från en klinisk studie av patienter med andningssvikt har visat att högre patientens syrenivåer paradoxalt nog är förknippade med en ökning av allvarliga bakterieinfektioner och högre dödlighet⁷, vilket tyder på att extra syre kan bidra till sjukdomspatogenes. Effekten av extra syre på cystisk fibros lung mikrobiom och tillhörande lung- och luftvägarna mikrobiella samhällen har inte studerats väl.

Mekanistiska studier kan ofta inte utföras direkt på mänskliga ämnen på grund av logistiska svårigheter och potentiella etiska frågor i samband med interventioner av okänd medicinsk nytta eller skada. Translationella metoder som integrerar mänskliga biospecimens i modellsystem kan erbjuda viktiga biologiska insikter i dessa fall. Medan förmågan att använda eller tolerera syre traditionellt har varit en viktig komponent i mikrobiell klassificering, är lite känt om hur den terapeutiska introduktionen av extra syre till miljön kan störa luftvägarna mikrobiella samhällen. För att belysa de okända effekterna av extra syre på pwCF:s luftvägsmikrobiomer behövde vi ta itu med två stora utmaningar. För det första skapandet av ett odlingsmedium som fysiologiskt approximerar sammansättningen av CF sputum; För det andra, skapandet av ett modellsystem som gör det möjligt att upprätthålla förhöjda syrekoncentrationer i kulturen under längre tidsperioder.

Konstgjorda sputum media (ASM) används ofta för att efterlikna lung sputum ex vivo^8,9,10, men det finns ingen tydlig konsensus om ett specifikt recept. Detta protokoll beskriver en konstgjord sputum medium recept och beredning strategi noggrant utformad för fysiologiskt approximim sputum från pwCF. I tabell 1 beskrivs de valda receptvärdena baserat på publicerad litteratur. Grundläggande kemiska komponenter och pH matchades med värden som identifierats genom studier av human CF sputum^11,12,13. Låg koncentration fysiologiska näringsämnen tillsattes med äggula, som inkluderades som 0,25% av den slutliga volymen¹⁰, liksom vitamin och spårmetallblandningar^14,15. Mucin, nyckelkomponenten i sputum¹⁶, inkluderades vid 1% w/v¹⁴. Även om det var mer arbetsintensivt valdes filtersterilisering över den mer konventionella metoden med värmesterilisering för att minska potentiella problem från värmeinducerad denaturering av väsentliga mediekomponenter¹⁰. En ytterligare fördel med filtersterilisering är att det genererar media som är transparenta (värmesterilisering kan skapa grumliga medier på grund av utfällning och koagulering av salter och proteiner), vilket gör att detta konstgjorda sputummedium kan användas för att följa mikrobiell tillväxt baserat på ökningar av grumlighet.

Detta modellsystem för den hyperoxiska kulturen är baserat på anaeroba odlingstekniker där syre tillsätts snarare än avlägsnas, vilket skapar en modell för effekten av kompletterande syreanvändning för pwCF. Figur 1 och det tillhörande syresparningsprotokollet beskriver komponenterna i ett syresparsystem, som kan erhållas till låg kostnad från allmänna laboratorie- och sjukhusleverantörer. Detta system möjliggör blandning av komprimerat syre och luft till fasta koncentrationer som sträcker sig från 21%-100% syre. Integreringen av en syresensor möjliggör verifiering av koncentrationen av utgångsgasblandningen, samt kontroll av utflödesgassammansättningen hos tidigare spargade serumflaskor för att verifiera att syreförhållandena har hållits inom önskat intervall.

Detta protokoll beskriver förfaranden för att skapa ett artificiellt sputum medium, konstruktion och användning av ett syre sparging system, och tillämpningen av båda att odla CF sputum under differentiella syreförhållanden.

Protocol

Denna studie fick godkännande från Partners Institutional Review Board (protokoll # 2018P002934). Inklusionskriteriumet inkluderade vuxna patienter med cystisk fibros som gav skriftligt informerat samtycke till studien. Det fanns inget uteslutningskriterium. Enligt protokoll riktlinjer samlades alla sputum prover från patienter med cystisk fibros under ett planerat öppenvårdsbesök med sin kliniska leverantör. 1. Konstgjord Sputum Medium Förberedelse OBS: De kv…

Representative Results

Dessa protokoll tillämpades på 50 expectorated sputum prover från pwCF presenterar för rutinmässig vård till en öppenvården cystisk fibros klinik vid Massachusetts General Hospital i Boston, Massachusetts. Varje patients sputum odlades under 21%, 50% och 100% syre villkor med hjälp av konstgjorda sputum medium, med 0,5 mL alikvoter tas från varje kultur vid 24 h, 48 h och 72 h kultur tid för testning. Kulturer fotograferades när extraktioner gjordes för att spåra visuella förändringar. Dessutom togs en 0,…

Discussion

I denna studie utvecklades en in vitro-modell för att studera effekten av hyperoxia på lungmikrobiella samhällen. Denna modell, baserad på artificiell sputum medium och daglig sparning av serumflaskor, upprätthåller förhöjda syrekoncentrationer och stöder tillväxten av mikrober som identifierats i sputum från pwCF.

Det finns flera kritiska steg i detta tillvägagångssätt. Först är valet att använda filtersterilisering snarare än värmesterilisering av det konstgjorda …

Materials

BME Vitamins (100x) Solution	MilliporeSigma	B6891	Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021	Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion	HiMedia	FD045	Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen	MilliporeSigma	F7879	Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner	Integra Biosciences	144000	Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge	MilliporeSigma	20469	Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle	Becton Dickinson	309580	Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment	World Precision Instruments	14011	Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-346-15FM	Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution	MilliporeSigma	M5550	Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution	MilliporeSigma	M7145	Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor	MSA	814365	Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach	MilliporeSigma	M2378	Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit	Harvard Apparatus	72-1413	Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System	Illumina	770-2016-025-N	Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-540-15FM	Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors	SunMed	2001-01	Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer	Marshall Scientific	CO-PC420	Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride	MilliporeSigma	P9541	Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape	VWR	470042-938	Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge	MilliporeSigma	QGARD00D2	Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles	ThermoFisher Scientific	06-423A	Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set	Braun Medical	471960	Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride	MilliporeSigma	S3014	Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load)	ZymoBIOMICS	D6320	Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes	Professional Disposables International	H04082	Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank	Airgas	AI USP200	Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank	Airgas	OX USP200	Compressed oxygen tank for input to sparging system.