Bu protokol, anestezi uygulanan domuzlarda ortak peroneal sinirin elektriksel stimülasyonu yoluyla elde edilen in vivo tork verilerinin değerlendirilmesi ve yorumlanması ile ilgili kısa deneysel ayrıntıları açıklamaktadır.
İskelet kas gücünün güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi hastalığı ve yaralanma çalışmalarında, özellikle rejeneratif tedavilerin etkinliğini değerlendirirken, tartışmasız en önemli sonuç ölçüsüdür. Ek olarak, birçok rejeneratif terapiyi çevirmenin kritik bir yönü, büyük bir hayvan modelinde ölçeklenebilirliğin ve etkinliğin gösterilmesidir. Temel bilim çalışmalarında, özellikle küçük hayvan modellerinde intrinsik kas fonksiyon özelliklerini değerlendirmek için çeşitli fizyolojik preparatlar oluşturulmuştur. Uygulamalar şu şekilde kategorize edilebilir: in vitro (izole lifler, lif demetleri veya tüm kas), in situ (sağlam vaskülarizasyon ve innervasyona sahip kas, ancak bir kuvvet dönüştürücüsüne bağlı distal tendon) ve in vivo (kas veya kas ünitesinin yapıları bozulmadan kalır). Bu hazırlıkların her birinin güçlü ve zayıf yönleri vardır; Bununla birlikte, in vivo mukavemet testinin açık bir avantajı, aynı hayvanda tekrarlanan ölçümler yapabilme yeteneğidir. Burada, anestezi uygulanan domuzlarda standart peroneal elektriksel stimülasyona yanıt olarak arka bacak dorsiflekstor kasları tarafından üretilen izometrik torku in vivo olarak güvenilir bir şekilde değerlendirmek için kullanılan materyal ve yöntemler sunulmuştur.
İskelet kasının birincil işlevi, sonuçta nefes alma, yeme ve ambulasyon gibi aktiviteleri mümkün kılan kuvvet üretmektir. İskelet kası fonksiyonel kapasitesini azaltan koşullar, performansın azalmasına (mesleki veya spor), sakatlığa veya ölüme neden olabilir. Örneğin, yaşlanan toplumlarda kas kütlesinin ve fonksiyonunun korunması, yaşam kalitesi ve günlük yaşamın temel ve enstrümantal aktivitelerini gerçekleştirme kapasitesi ile pozitif ilişkilidir 1,2. Duchenne musküler distrofisi hastalarında kas gücünün azalması, ambulasyon yetersizliği ve solunum yetmezliği ile sonuçlanır ve sonuçta erken mortaliteye katkıda bulunur 3,4,5. Bu nedenle, kas gücü ölçümü, nöromüsküler hastalık veya yaralanma içeren çalışmalarda kritik bir sonuç ölçüsüdür.
Maksimum gönüllü izometrik veya izokinetik tork (ve / veya yorulma indeksi) genellikle klinik çalışmalarda fonksiyonel kapasitenin bir indeksi olarak kullanılır6. Hayvan çalışmalarında, anestezi altındayken elektriksel sinir stimülasyonu kullanılarak in vivo olarak benzer ölçümler yapılabilir. Özellikle, in vivo preparatlar kas sistemi, tendonlar, vaskülatür ve innervasyon bozulmadan kalan minimal invazivdir ve bu nedenle tekrarlanan fonksiyonel değerlendirmelere izin verir 7,8,9,10,11. Bu preparat genellikle küçük kemirgen modellerinde ve daha az ölçüde tavşan12, köpekler 13,14, koyun15 ve domuzlar 16,17 gibi daha büyük hayvan modellerinde kullanılır. Bu metodolojinin genel kullanımı, spinal müsküler atrofinin (SMA) genetiği değiştirilmiş domuz (domuz) modellerinde olduğu gibi birçok translasyonel araştırma çalışmasına etkili olabilir18. Bu yazıda, in vivo olarak domuz dorsiflekstor kas grubunun sinir stimülasyonuna bağlı maksimal izometrik torkunu değerlendirme yöntemleri sunulmuştur. Sunulan teknikler başlangıçta fare ön krural kas torku 19,20’yi değerlendirmek için orijinal olarak geliştirilenlerden uyarlandı ve daha sonra yaralanma sonrası tork üretme kapasitesini araştıran deneyimlerle rafine edildi 17,21,22,23,24,25,26,27,28 ve geliştirme sırasında çeşitli domuz modellerinde16.
Bu protokol, bir yük hücresi ve elektriksel uyarıcı ile entegre bir bilgisayar gerektiren metodolojiyi kullanarak in vivo izometrik tork ölçümünü vurgulamaktadır. Burada sunulan yöntemler, ticari olarak temin edilebilen entegre bir Domuz İzometrik Ayak Plakası Test Aparatı, platform aparatı ve ilgili yazılımı kullanır (bkz. Bununla birlikte, metodoloji ticari olarak temin edilebilen veya ısmarlama diğer yazılımları, veri toplama cihazlarını ve uyarıcıları kullanacak şekilde uyarlanabilir. Bu yöntemler, aşağıdakiler gibi standart ekipmanlarla dolu özel bir büyük hayvan cerrahi süitinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır: kilitleme cerrahi masası, test platformu için eşit yükseklikte ikinci kilitleme masası, ventilatör ve izleme cihazları ve vücut ısısını korumak için ısıtma matı veya diğer cihazlar.
Bu yöntemleri uygulamak için aşağıdaki ekip üyelerine ihtiyaç vardır: fonksiyonel testi gerçekleştirmek için bir yetenekli anestezi teknisyeni ve iki çalışma personeli. Bu insanlar, platform aparatı üzerindeki uzuvların ilk stabilizasyonu için birlikte çalışacaklardır. Daha sonra, iki personelden biri elektrot yerleştirme / konumlandırma ve diğeri test sırasında bilgisayar uygulamalarından sorumlu olacaktır.
Kritik adımlar, değişiklikler ve sorun giderme
Veri değişkenliğini en aza indirmek ve yaklaşımın başarısını en üst düzeye çıkarmak için aşağıdaki kritik adımlar vurgulanmıştır.
Optimal sinir stimülasyonu
Bu deneysel yaklaşım sinir akson depolarizasyonu ile başlar ve doğru elektrot yerleşimine ve optimize edilmiş elektriksel stimülasyona dayanır. Boney işaretleriyle ilgili sinir anatomisinin ölüm sonrası analizi, test sırasında uygun elektrot yerleşimini görselleştirmeye yardımcı olabilir. Maksimum seğirme torku elde etmek, sinir aksonuna iletilen uygun akımı (miliamper cinsinden; mA) belirlemeye yardımcı olur. Testin başlangıcında sinir stimülasyonunu optimize ederken akılda tutulması gereken iki değer vardır: (1) seğirme-tetanik oran ~1: 5’tir, örneğin, ~2 N · m seğirme torku 10 N · m tetanik torka karşılık gelir (Şekil 3); ve (2) vücut kütlesine tipik tork, kg vücut kütlesi başına ~ 0.3 N · m’dir (Şekil 4). Tepe seğirme torkları düşük görünüyorsa, elektrotları çıkarın ve başka bir yerleştirme deneyin. Stimülatör ayarlarını, BNC bağlantılarını ve elektrot bağlantılarını kontrol ettiğinizden emin olun. Yukarıda belirtildiği gibi, uzuvun eklem açıları arasında konumlandırılması sırasında çok fazla hareket varsa, kasılmalar arasında elektrot yeniden yerleştirilmesi gerekebilir (Şekil 2). Deneysel ve girişimsel yaklaşımların bu değerleri etkileyebileceğini lütfen unutmayın.
Uygun biyomekanik hizalama
Kas uzunluğunun başlaması kas kontraktil kuvvetini (uzunluk-gerginlik ilişkisi) etkiler ve kas uzunluğu kalça, diz ve ayak bileği eklem hizalamasına bağlı olarak değişebilir. Eklem açıları uzuvlar arasında ve domuzlar arasında standartlaştırılmalıdır. Kalça ve diz için 90° ayak bileği eklem açısı şiddetle tavsiye edilir. Hafif plantarfleks ayak bileği pozisyonu (nötr 0° ayak bileği eklem açısından ~ 30°) tepe kuvveti için idealdir. Ayakta dururken hem domuzlarda hem de köpeklerde ayak bileği ekleminin doğal anatomik pozisyonunu yansıtır. Tüm bağlantılar, dikey bir tork vektörünün katkısı nedeniyle ölçülebilir tork kaybını önlemek için ayak pedalı ve tork dönüştürücüleri ile paralel olmalıdır. Kalça-diz-ayak bileği eklem açılarının ve ayak-pedal-eklem hizalamasının incelenmesi, ayağın ayak pedalına sabitlenmesinden ve diz ekleminin uzuv sıkma çubuklarıyla sabitlenmesinden sonra şiddetle tavsiye edilir (Şekil 1). Yanlış hizalama varsa, çubukların kilidini açıp çıkarın ve domuzu ameliyat masasında yeniden konumlandırın. Çalışmalar arasında eklem açılarını standartlaştırmak, veri varyansını en aza indirmek için kritik öneme sahip olsa da, aşağıda tartışılan, dikkate değer biyomekanik hizalamada sınırlamalar vardır.
Mevcut veya alternatif yöntemlere göre önemi
Domuz modelleri için kullanılabilecek klinik olarak ilgili ve invaziv olmayan kas fonksiyonu değerlendirmelerinin alternatif örnekleri arasında koşu bandı yürüme mesafesi, EMG ve aktif kas kesme dalgası elektrografisi bulunmaktadır. İnsanlarda 6 dakikalık yürüme testi olarak, bir koşu bandı yürüyüş testi, büyük hayvanlarda hastalığın ilerlemesini ve müdahale başarısını değerlendirebilir33,34,35. Tipik olarak, bir alışma döneminden sonra, hayvanlar farklı koşu bandı hızlarında ve / veya eğim seviyelerinde uyumun sonuna kadar yürür. Maksimum motivasyona ulaşmak için yiyecek ödülleri genellikle gereklidir. Bununla birlikte, koşu bandı yürüme sonuçları, denek motivasyonu, maksimal olmayan motor ünite alımı ve kardiyovasküler, iskelet ve solunum sistemleri gibi diğer vücut sistemlerine doğal bağımlılık gibi sınırlamalar nedeniyle kas kontraktil fonksiyonunun yalnızca dolaylı yorumlarını sunar.
Öte yandan, EMG elektrotları doğrudan ilgilenilen kas grubuna yerleştirildiği için EMG iskelet kası sisteminin biraz daha iyi bir doğrudan değerlendirmesini sunar36,37,38. EMG elektrotları daha sonra kolektif kas aktivitesini ölçer (depolarize kas lifleri). Bu kas aktivitesi, motor ünite işe alımına ve oran kodlamasına (işe alınan motor birimlere gönderilen aksiyon potansiyellerinin sıklığı) dayanır. Bununla birlikte, motor ünite işe alımının göreceli katkılarını oran kodlamasına karşı ayırmak, yüzey EMG ile imkansızdır. Ayrıca, EMG, maksimum kasılmalar üretmek için özne istekliliğine dayanır ve bu işbirliği seviyesi büyük hayvan modellerinde olası değildir. Yürüme döngüsü sırasında EMG’deki değişiklikleri değerlendirmek bilgilendirici olsa da, bu veriler ilgilenilen iskelet kası grubunun maksimum fonksiyonel yeteneğini temsil etmemektedir. B-mod ve kesme dalgası elastografisi kullanan ultrason tabanlı görüntüleme, kas fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan bir başka non-invaziv modalitedir. Elastografi ile ölçülen Young modülü ile artan kas yükleri39,40 arasında iyi bir korelasyon vardır. Kesme dalgası elastografisi doğrulanmıştır ve domuz volümetrik kas kaybı hasarı modeli 23 de dahil olmak üzere pasif doku sertliğinin kantitatif bir ölçüsü olarak41,42,43,44,45 olarak kullanılmıştır. Aktif kas kuvveti üretiminin dolaylı bir ölçümü olarak da kullanılabilir39. Bununla birlikte, konstrüksiyonları gerçekleştirmek için özne istekliliği ve işbirliği için EMG’ye benzer sınırlamalar hala mevcuttur.
Burada açıklanan in vivo protokol, koşu bandı yürüme mesafesi ve EMG’nin aksine, kas fonksiyonunun güvenilir, tekrarlanabilir ve maksimum bir değerlendirmesini sağlar. Bu protokol, kas kasılmalarını motivasyondan bağımsız, kontrollü, ölçülebilir bir şekilde uyandırır. Spesifik olarak, perkütan elektrotlar, merkezi sinir sistemini atlayan sinir aksonlarını uyarmak için kullanılır. Sinir aksonlarının depolarizasyonu, motor ünite alımı ile ilişkili değişkenliği ortadan kaldırarak tüm motor ünitelerini meşgul eder. Ek olarak, araştırmacı hız kodlamasını (stimülasyon frekansı) kontrol eder. Bu yaklaşım için geçerli olan nöromüsküler fizyoloji, Ranvier’in düğümlerinde voltaj kapılı sodyum kanal aktivasyonu ile başlar. Uyarılma-kasılma bağlantısı ve çapraz köprü bisikleti dahil olmak üzere tüm sonraki (veya aşağı akış) fizyoloji devreye girer. İn vivo non-invaziv kas analizinin önemli bir avantajı, kontraktil kas fonksiyonunun, örneğin yaralanma, müdahale veya bir hastalık ilerlemesi sonrası kas gücünü izlemek için haftalık olarak tekrar tekrar ölçülebilmesidir.
Yöntemin sınırlamaları
Bu protokolde açıklanan in vivo ekipman, eklem açısı ve stimülasyon frekansının bir fonksiyonu olarak pasif ve aktif izometrik torka izin verir. Kullanılan test cihazı, dinamik kasılmaların (örneğin, izokinetik eksantrik veya konsantrik kasılmalar) ölçülmesini desteklemez. Aparat tork-mafsal açısı ilişkisini karakterize etmek için 105° hareket aralığına izin verir ve maksimum tork aralığı ~50 N·m olan bir yük hücresi kullanır. Belirli deneysel sorular, bu spesifikasyonların dışındaki performans özelliklerini gerektirebilir. Özellikle, bu tarif edilen aparat üzerindeki yük hücresi, gerekirse daha büyük tork aralıkları ile değiştirilebilir.
İn vivo maksimum nöromüsküler gücü ölçmek için burada açıklanan protokolün dikkate değer sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu yöntem, hayvan tesisi protokollerine ve kaynaklarına göre farklı şekilde yürütülebilen anestezi gerektirir. Anesteziklerin nöromüsküler fonksiyon üzerinde farklı etkileri olduğu bilinmektedir ve fare in vivo dorsifleksör tork üretimini anestezik tip ve doza bağımlı bir şekilde değiştirdiği gösterilmiştir29. Anesteziklerin büyük hayvan in vivo torku üzerindeki diferansiyel etkileri belirsizdir; bu nedenle, kontrol ve deney grupları bu değişkenliği kontrol etmek için aynı anestezi ajanlarına (örneğin, ketamin uygulanan tüm gruplara) sahip olmalıdır. İkincisi, in vivo difüzyon paternlerine güvenmek, kontraktil disfonksiyonun hücresel mekanizmalarının ve akut ilaç toksisitelerinin araştırılmasını sınırlar. Örneğin, kafein, sarkoplazmik retikulum kalsiyum salınımını uyarmak için izole bir kasın in vitro organ banyosu testi sırasında, uyarılma-kasılma kuplajını doğrudan atlayarak kullanılabilir. Bu etkiyi indükleyen kafein miktarı (mM) in vivo bir ortamda öldürücüdür. Tüm vücut üzerindeki ilaç etkileri (örneğin, böbrek / karaciğer stresi) ve dolaşıma salgılanan müteakip faktörler, bu yaklaşımın akut kas kuvveti23 üzerinde ilaç taraması için kullanılması durumunda dikkate alınması gerekecektir. Üçüncüsü, maksimal elektriksel sinir stimülasyonunun kullanımı, yukarıda tartışıldığı gibi, gönüllü işe alım stratejilerinden sapmaktadır ve bu nedenle nöromüsküler işe alım adaptasyonlarından kaynaklanabilecek güç değişikliklerini yansıtmamaktadır.
İn vivo tork ölçümleri, deneysel gözlemler için belirli bir mekanizma oluşturma konusunda da sınırlı olabilir. Örneğin, ayak bileği eklemi hakkındaki tork sadece kas kuvveti üretimine değil, aynı zamanda tendon ve eklem ve bağ dokusu özelliklerine de bağlıdır. Dahası, kuvvet kas grupları, özellikle plantar fleksörler (gastroknemius, soleus ve plantaris kasları) ve domuzlardaki dorsifleksörler (peroneus tertius, tibialis ve digitorum kasları) tarafından üretilir. Bu nedenle, maksimum in vivo tork verilerinin yorumlanması, potansiyel kas-iskelet ve anatomik değişikliklerin dikkate alınmasını gerektirir ve bireysel kaslarla değil, kas gruplarıyla sınırlıdır. Buna bağlı olarak, kas grupları genellikle plantar fleksörlerin gastroknemius ve soleus kası gibi ağırlıklı olarak hızlı ve yavaş kas liflerinin bir karışımından oluşur. Kasılma ve gevşeme hızı (veya zirveye ulaşma süresi ve yarı gevşeme süresi) gibi kasılma özellikleri, in vitro veya in situ test protokolleri47 gibi izole kas preparatlarına karşı in vivo kullanan lif tipi fizyolojinin güvenilir göstergeleri değildir. İzole kas preparatları, biyomekanik parametrelerin kas fonksiyonu üzerindeki etkisini anlamada da üstündür, çünkü kas uzunluğu gibi özellikler hassas bir şekilde kontrol edilebilir; eklem açısı-tork ilişkisinin kas uzunluğu-kuvvet ilişkisine doğrudan eşdeğer olmadığını vurgulamak önemlidir, çünkü tork üretimine katkıda bulunan tendon (örneğin, gevşeklik), kas (örneğin, pennasyon açısı, sarkomer örtüşmesi) ve eklem (örneğin, moment kolu) özellikleri eklem açısına bağlıdır. Bu amaçla, büyük hayvan in situ fonksiyonel testi 48, in situ testin bir terminaldeneyi olduğunu akılda tutarak, in vivo teste değerli bir katkı olabilir. Deneysel bulguların mekanik anlayışını geliştirmek için gelecekte araştırılabilecek mevcut protokoldeki diğer ilerlemeler arasında kas ve tendon mimari özelliklerini ölçmek için ultrason B modu görüntülemenin kullanılması ve gönüllü ve elektriksel olarak uyarılan kasılmalar sırasında kas kuvvetini ölçmek için bir tendon kuvvet dönüştürücüsünün implantasyonuyer almaktadır 49.
Yöntemin önemi ve potansiyel uygulamaları
Bu protokol, domuz dorsifleksör kas grubunun in vivo tork üretme kapasitesini değerlendirir ve fizyolojik bir ortamda kas fonksiyonunun kazanımını veya kaybını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yöntem gösterir. Metodoloji domuz için terminal olmadığından, bir hastalığın ilerlemesi sırasında veya bir tedavi stratejisinden önce, sırasında ve sonrasında aynı deneklerdeki kas fonksiyonunu uzunlamasına değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu nedenle, tekrarlanan bir önlem deneysel tasarımı, bağımsız ölçümlere kıyasla daha fazla güç ve daha az hayvanla sağlam istatistiksel karşılaştırmalara izin verebilir. Ek olarak, iskelet kası disfonksiyonu, kronik hastalıkla ilişkili kas israfı (örneğin, kalp yetmezliği, böbrek yetmezliği, AIDS, kanser, vb.), Kas distrofisi, nörodejeneratif hastalıklar (örneğin, SMA veya amiyotrofik lateral skleroz; ALS), yaşlanma (yani sarkopeni) ve ilaç toksisiteleri. İskelet kası fonksiyonel kapasitesi, egzersiz, beslenme, ilaç ve rejeneratif tıp tedavileri gibi girişimler için kritik bir birincil sonuç ölçüsüdür. Bu nedenle, domuz torku üretim kapasitesini in vivo olarak güvenilir bir şekilde değerlendirmek için burada açıklanan protokol, çok sayıda çalışma uygulamasında kullanılabilir. Gelişmekte olan tedavilerin çevirisi için kapsamlı hayvan verilerinin elde edilmesinde etkili olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Sunulan çalışmalar ve veriler, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı tarafından BTC ve SMG’ye (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR) geniş çapta desteklenmiştir; ve Gazi İşleri Bakanlığı, Gaziler Sağlık İdaresi, Araştırma ve Geliştirme Ofisi (I21 RX003188) JAC ve Dr. Luke Brewster’a. Yazarlar, USAISR Veterinerlik Hizmeti ve Karşılaştırmalı Patoloji Dallarına ve UMN İleri Preklinik Görüntüleme Merkezi’ne bu çalışmaların tamamlanmasında teknik yardım için minnetle teşekkür eder.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |