El presente protocolo describe detalles experimentales concisos sobre la evaluación e interpretación de los datos de par in vivo obtenidos a través de la estimulación eléctrica del nervio peroneo común en cerdos anestesiados.
La evaluación confiable de la fuerza del músculo esquelético es posiblemente la medida de resultado más importante en los estudios de enfermedades y lesiones neuromusculares y musculoesqueléticas, particularmente cuando se evalúa la eficacia de las terapias regenerativas. Además, un aspecto crítico de la traducción de muchas terapias regenerativas es la demostración de escalabilidad y efectividad en un modelo animal grande. Se han establecido varias preparaciones fisiológicas para evaluar las propiedades intrínsecas de la función muscular en estudios de ciencias básicas, principalmente en modelos de animales pequeños. Las prácticas se pueden clasificar en: in vitro (fibras aisladas, haces de fibras o músculo entero), in situ (músculo con vascularización e inervación intactas pero tendón distal unido a un transductor de fuerza) e in vivo (las estructuras del músculo o unidad muscular permanecen intactas). Hay fortalezas y debilidades en cada uno de estos preparativos; sin embargo, una clara ventaja de las pruebas de resistencia in vivo es la capacidad de realizar mediciones repetidas en el mismo animal. Aquí, se presentan los materiales y métodos para evaluar de manera confiable el par isométrico producido por los músculos dorsiflexores de las extremidades posteriores in vivo en respuesta a la estimulación eléctrica peronea estándar en cerdos anestesiados.
La función principal del músculo esquelético es producir fuerza, lo que en última instancia hace posible actividades como respirar, comer y deambular. Las condiciones que reducen la capacidad funcional del músculo esquelético pueden conducir a una disminución del rendimiento (ocupacional o deportivo), discapacidad o muerte. Por ejemplo, el mantenimiento de la masa muscular y la función en poblaciones envejecidas se asocia positivamente con la calidad de vida y la capacidad de realizar actividades básicas e instrumentales de la vida diaria 1,2. Y, la disminución de la fuerza muscular en pacientes con distrofia muscular de Duchenne resulta en la incapacidad de deambular e insuficiencia respiratoria, lo que en última instancia contribuye a la mortalidad prematura 3,4,5. Por lo tanto, la medición de la fuerza muscular es una medida de resultado crítica en estudios que involucran enfermedades o lesiones neuromusculares.
El par isométrico o isocinético voluntario máximo (y/o índice de fatiga) se utiliza a menudo como índice de capacidad funcional en estudios clínicos6. En estudios con animales, las mediciones análogas se pueden hacer in vivo utilizando estimulación nerviosa eléctrica mientras se está bajo anestesia. En particular, las preparaciones in vivo son mínimamente invasivas con musculatura, tendones, vasculatura e inervación que permanecen intactos y, por lo tanto, permiten evaluaciones funcionales repetidas 7,8,9,10,11. Esta preparación se usa comúnmente en modelos de roedores pequeños y, en menor medida, en modelos animales más grandes como conejos12, perros 13,14, ovejas15 y cerdos16,17. El uso general de dicha metodología podría ser impactante para muchos estudios de investigación traslacional, como en modelos porcinos (cerdos) genéticamente modificados de atrofia muscular espinal (AME)18. Aquí se presentan métodos para evaluar el par isométrico máximo inducido por estimulación nerviosa del grupo muscular dorsiflexor porcino in vivo. Las técnicas presentadas se adaptaron inicialmente de las desarrolladas originalmente para evaluar el par muscular crural anterior del ratón19,20 y posteriormente se refinaron a través de la experiencia investigando la capacidad de producción de par después de una lesión 17,21,22,23,24,25,26,27,28 y durante el desarrollo16 en varios modelos porcinos.
Este protocolo destaca la medición isométrica de par in vivo mediante una metodología que requiere un ordenador integrado con una célula de carga y un estimulador eléctrico. Los métodos presentados aquí utilizan un aparato de prueba de placa de pie isométrica porcina integrado disponible comercialmente, un aparato de plataforma y el software correspondiente (consulte la Tabla de materiales). Sin embargo, la metodología se puede adaptar para utilizar otro software disponible comercialmente o hecho a medida, dispositivos de adquisición de datos y estimuladores. Estos métodos están diseñados para su uso en una sala quirúrgica dedicada a animales grandes repleta de equipos estándar, tales como: mesa quirúrgica de bloqueo, segunda mesa de bloqueo de igual altura para la plataforma de prueba, ventilador y dispositivos de monitoreo, y estera de calefacción u otros dispositivos para mantener la temperatura corporal.
Se necesitan los siguientes miembros del equipo para llevar a cabo estos métodos: un técnico de anestesia calificado y dos miembros del personal del estudio para realizar las pruebas funcionales. Estas personas trabajarán juntas para la estabilización inicial de la extremidad en el aparato de la plataforma. Luego, uno de los dos miembros del personal será responsable de la colocación / posicionamiento del electrodo y el otro de las aplicaciones informáticas durante las pruebas.
Pasos críticos, modificaciones y solución de problemas
Para minimizar la variabilidad de los datos y maximizar el éxito del enfoque, se destacan los siguientes pasos críticos.
Estimulación nerviosa óptima
Este enfoque experimental comienza con la despolarización del axón nervioso y se basa en la colocación correcta de los electrodos y la estimulación eléctrica optimizada. Un análisis post mortem de la anatomía nerviosa relacionada con los puntos de referencia óseos puede ayudar a visualizar la colocación adecuada de los electrodos durante las pruebas. La adquisición del par de contracción máximo ayuda a determinar la corriente apropiada (en miliamperios; mA) entregada al axón nervioso. Hay dos valores a tener en cuenta al optimizar la estimulación nerviosa al inicio de las pruebas: (1) la relación contracción-tetánica es de ~1:5, por ejemplo, ~2 N·m de par de contracción corresponde a un par de contracción de 10 N·m (Figura 3); y (2) el par típico a la masa corporal es de ~0,3 N·m por kg de masa corporal (Figura 4). Si los pares de contracción máximos parecen bajos, retire los electrodos e intente otra colocación. Asegúrese de verificar la configuración del estimulador, las conexiones BNC y las conexiones de electrodos. La colocación del electrodo puede ser necesaria entre las contracciones si hay demasiado movimiento durante el posicionamiento de la extremidad entre los ángulos de las articulaciones, como se señaló anteriormente (Figura 2). Tenga en cuenta que los enfoques experimentales e intervencionistas podrían afectar estos valores.
Alineación biomecánica adecuada
La longitud del músculo inicial influye en la fuerza contráctil muscular (la relación longitud-tensión), y la longitud muscular puede cambiar según la alineación de la articulación de la cadera, la rodilla y el tobillo. Los ángulos articulares deben estandarizarse entre las extremidades y entre los cerdos. Se recomienda encarecidamente un ángulo de 90 ° de la articulación del tobillo para la cadera y la rodilla. Una posición de tobillo ligeramente plantarflexionada (~ 30 ° desde el ángulo neutro de la articulación del tobillo de 0 °) es óptima para la fuerza máxima. Refleja la posición anatómica natural de la articulación del tobillo tanto en cerdos como en perros mientras están de pie. Todas las uniones también deben ser paralelas con el pedal y los transductores de par para evitar la pérdida de par medible debido a la contribución de un vector de par perpendicular. Se recomienda encarecidamente inspeccionar los ángulos de la articulación cadera-rodilla-tobillo y la alineación de la articulación pie-pedal-articulación después de asegurar el pie al pedal y asegurar la articulación de la rodilla con las barras de sujeción de la extremidad (Figura 1). Si hay desalineación, desbloquee y retire las barras y vuelva a colocar al cerdo en la mesa quirúrgica. Si bien la estandarización de los ángulos conjuntos entre los estudios es fundamental para minimizar la varianza de los datos, existen limitaciones para la alineación biomecánica que son notables, que se analizan a continuación.
Importancia con respecto a los métodos existentes o alternativos
Los ejemplos alterativos de evaluaciones clínicamente relevantes y no invasivas de la función muscular que podrían usarse para modelos porcinos incluyen la distancia a pie en cinta de correr, la EMG y la electrografía de onda de cizallamiento muscular activa. Como la prueba de caminata de 6 minutos en humanos, una prueba de caminata en cinta puede evaluar la progresión de la enfermedad y el éxito de la intervención en animales grandes 33,34,35. Por lo general, después de un período de aclimatación, los animales se caminan hasta el final del cumplimiento a diferentes velocidades de cinta de correr y / o niveles de inclinación. Las recompensas alimentarias a menudo son necesarias para lograr la máxima motivación. Sin embargo, los resultados de caminar en cinta de correr ofrecen solo interpretaciones indirectas de la función contráctil muscular debido a limitaciones como la motivación del sujeto, el reclutamiento de unidades motoras no máximas y la codependencia inherente de otros sistemas corporales como los sistemas cardiovascular, esquelético y respiratorio.
Por otro lado, EMG ofrece una evaluación directa ligeramente mejor del sistema muscular esquelético, ya que los electrodos EMG se colocan directamente sobre el grupo muscular de interés 36,37,38. Los electrodos EMG luego miden la actividad muscular colectiva (fibras musculares despolarizadas). Esta actividad muscular se basa en el reclutamiento de unidades motoras y la codificación de la tasa (la frecuencia de los potenciales de acción enviados a las unidades motoras reclutadas). Sin embargo, separar las contribuciones relativas del reclutamiento de unidades motoras versus la codificación de tasas es imposible con EMG de superficie. Además, EMG se basa en la voluntad del sujeto para generar contracciones máximas, y este nivel de cooperación es poco probable en modelos de animales grandes. Si bien puede ser informativo evaluar los cambios en la EMG durante el ciclo de la marcha, estos datos no representan una capacidad funcional máxima del grupo muscular esquelético de interés. Las imágenes basadas en ultrasonido que utilizan el modo B y la elastografía de onda de corte es otra modalidad no invasiva utilizada para evaluar la función muscular. Existe una buena correlación entre el módulo de Young medido por elastografía y el aumento de las cargas musculares 39,40. La elastografía de onda de cizallamiento ha sido validada y utilizada como medida cuantitativa de la rigidez pasiva del tejido 41,42,43,44,45, incluso en un modelo de lesión por pérdida muscular volumétrica porcina23. También se puede utilizar como una medida indirecta de la producción de fuerza muscular activa39. Sin embargo, las limitaciones similares a EMG para la disposición del sujeto y la cooperación para realizar contracciones todavía están presentes.
El protocolo in vivo descrito aquí, en contraste con la distancia de caminata en cinta rodante y EMG, proporciona una evaluación confiable, reproducible y máxima de la función muscular. Este protocolo evoca las contracciones musculares de una manera controlada y cuantificable que es independiente de la motivación. Específicamente, los electrodos percutáneos se utilizan para estimular los axones nerviosos que evitan el sistema nervioso central. La despolarización de los axones nerviosos involucra a todas las unidades motoras eliminando la variabilidad asociada con el reclutamiento de unidades motoras. Además, el investigador controla la codificación de la tasa (frecuencia de estimulación). La fisiología neuromuscular resultante que se aplica a este enfoque comienza con la activación del canal de sodio dependiente de voltaje en los nodos de Ranvier. Toda la fisiología posterior (o aguas abajo) está comprometida, incluido el acoplamiento excitación-contracción y el ciclo de puente cruzado. Una ventaja significativa del análisis muscular no invasivo in vivo es que la función muscular contráctil se puede medir repetidamente, por ejemplo, semanalmente, para controlar la fuerza muscular después de una lesión, intervención o sobre la progresión de una enfermedad.
Limitaciones del método
El equipo in vivo descrito en este protocolo permite el par isométrico pasivo y activo en función del ángulo articular y la frecuencia de estimulación. El aparato de prueba utilizado no admite la medición de contracciones dinámicas (por ejemplo, contracciones isocinéticas excéntricas o concéntricas). El aparato permite un rango de movimiento de 105 ° para caracterizar la relación de ángulo de par-articulación y utiliza una célula de carga con un rango de par máximo de ~ 50 N·m. Las preguntas experimentales específicas pueden requerir características de rendimiento fuera de estas especificaciones. En particular, la célula de carga en este aparato descrito puede cambiarse por mayores rangos de par si es necesario.
El protocolo descrito aquí para medir la fuerza neuromuscular máxima in vivo tiene limitaciones notables. Primero, este método requiere anestesia, que puede llevarse a cabo de manera diferente según los protocolos y recursos de las instalaciones para animales. Se sabe que los anestésicos tienen efectos variables sobre la función neuromuscular y se ha demostrado que alteran la producción de par dorsiflexor in vivo del ratón de una manera anestésica y dependiente de la dosis29. Los efectos diferenciales de los anestésicos sobre el par in vivo de los animales grandes no están claros; por lo tanto, los grupos de control y experimentales deben tener los mismos agentes anestésicos (por ejemplo, todos los grupos a los que se les administró ketamina) para controlar esta variabilidad. En segundo lugar, la dependencia de los patrones de difusión in vivo limita la exploración de los mecanismos celulares de la disfunción contráctil y las toxicidades agudas de los medicamentos. Por ejemplo, la cafeína se puede utilizar durante las pruebas de baño de órganos in vitro de un músculo aislado para estimular la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico, evitando el acoplamiento excitación-contracción46 directamente. La cantidad de cafeína para inducir este efecto (mM) es letal en un entorno in vivo . Las influencias de los medicamentos en todo el cuerpo (por ejemplo, el estrés renal / hepático) y los factores posteriores secretados en la circulación deberán considerarse si este enfoque se utiliza para la detección de drogas en la fuerza muscular aguda23. En tercer lugar, el uso de la estimulación nerviosa eléctrica máxima se desvía de las estrategias de reclutamiento voluntario, como se discutió anteriormente, y por lo tanto no refleja los cambios en la fuerza que pueden deberse a las adaptaciones de reclutamiento neuromuscular.
Las mediciones de par in vivo también pueden limitarse con respecto al establecimiento de un mecanismo específico para las observaciones experimentales. Por ejemplo, el torque alrededor de la articulación del tobillo depende no solo de la producción de fuerza muscular, sino también del tendón y las propiedades del tejido conectivo y articular. Además, la fuerza es generada por grupos de músculos, específicamente los flexores plantares (músculos gastrocnemio, sóleo y plantaris) y los dorsiflexores (músculos peroneus tertius, tibialis y digitorum) en cerdos. Por lo tanto, las interpretaciones de los datos de par máximo in vivo requieren la consideración de posibles cambios musculotendinosos y anatómicos y se limitan a los grupos musculares, no a los músculos individuales. Relacionadamente, los grupos musculares a menudo se componen de una mezcla de fibras musculares predominantemente rápidas y lentas, como el músculo gastrocnemio y el músculo sóleo, respectivamente, de los flexores plantares. Las propiedades contráctiles como la tasa de contracción y relajación (o el tiempo de contracción hasta el pico y el tiempo de relajación media) no son indicadores confiables de la fisiología del tipo de fibra que utiliza preparaciones musculares in vivo versus aisladas, como los protocolos de prueba in vitro o in situ 47. Las preparaciones musculares aisladas también son superiores en la comprensión de la influencia de los parámetros biomecánicos en la función muscular porque propiedades como la longitud muscular se pueden controlar con precisión; es importante enfatizar que la relación ángulo-par articular no es directamente equivalente a la relación longitud-fuerza muscular, ya que las propiedades del tendón (por ejemplo, holgura), músculo (por ejemplo, ángulo de pennación, superposición de sarcómeros) y articulación (por ejemplo, brazo de momento) que contribuyen a la producción de par dependen del ángulo de la articulación. Con ese fin, las pruebas funcionales in situ en animales grandes48 podrían ser una valiosa adición a las pruebas in vivo, teniendo en cuenta que las pruebas in situ son un experimento terminal. Otros avances al protocolo actual que pueden explorarse en el futuro para mejorar la comprensión mecanicista de los hallazgos experimentales incluyen el uso de imágenes de ultrasonido en modo B para medir las propiedades arquitectónicas musculares y tendinosas y la implantación de un transductor de fuerza tendinosa para medir la fuerza muscular durante las contracciones voluntarias y estimuladas eléctricamente49.
Importancia y aplicaciones potenciales del método
Este protocolo evalúa la capacidad de producción de par in vivo del grupo muscular dorsiflexor porcino, demostrando un método no invasivo para evaluar la ganancia o pérdida de la función muscular en un entorno fisiológico. Debido a que la metodología no es terminal para el cerdo, también se puede utilizar para evaluar la función muscular en los mismos sujetos longitudinalmente durante la progresión de una enfermedad, o antes, durante y siguiendo una estrategia de tratamiento. Como tal, un diseño experimental de medidas repetidas puede permitir comparaciones estadísticas robustas con mayor potencia y menos animales en comparación con medidas independientes. Además, la disfunción del músculo esquelético es un componente destacado de diversos procesos y afecciones de enfermedades, como el desgaste muscular asociado a enfermedades crónicas (por ejemplo, insuficiencia cardíaca, insuficiencia renal, SIDA, cáncer, etc.), distrofia muscular, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, AME o esclerosis lateral amiotrófica; ELA), envejecimiento (es decir, sarcopenia) y toxicidades por drogas. La capacidad funcional del músculo esquelético es una medida de resultado primaria crítica para intervenciones como el ejercicio, la nutrición y las terapias farmacológicas y de medicina regenerativa. Por lo tanto, el protocolo descrito en este documento para evaluar de manera confiable la capacidad de producción de par porcino in vivo puede usarse en numerosas aplicaciones de estudio. Puede ser fundamental en la adquisición de datos extensos de animales para la traducción de terapias en desarrollo.
The authors have nothing to disclose.
El trabajo y los datos presentados fueron ampliamente respaldados por el Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos a BTC y SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); y el Departamento de Asuntos de Veteranos, Administración de Salud de Veteranos, Oficina de Investigación y Desarrollo (I21 RX003188) a JAC y al Dr. Luke Brewster. Los autores agradecen al Servicio Veterinario y a las Ramas de Patología Comparada del USAISR y al Centro de Imágenes Preclínicas Avanzadas de la UMN por la asistencia técnica para completar estos estudios.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |