Direkte omprogrammering af musefibroblaster til melanocytter
Summary
Her beskriver vi et optimeret direkte omprogrammeringssystem til melanocytter og et højeffektivt, koncentreret virusemballagesystem, der sikrer jævn direkte omprogrammering.
Abstract
Tabet af funktion af melanocytter fører til vitiligo, som alvorligt påvirker de berørte individers fysiske og mentale sundhed. I øjeblikket er der ingen effektiv langsigtet behandling for vitiligo. Derfor er det bydende nødvendigt at udvikle en bekvem og effektiv behandling af vitiligo. Regenerativ medicin teknologi til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter synes at være en lovende ny behandling af vitiligo. Dette indebærer direkte omprogrammering af patientens hudceller til funktionelle melanocytter for at hjælpe med at forbedre tabet af melanocytter hos patienter med vitiligo. Denne metode skal dog først testes på mus. Selvom direkte omprogrammering er meget udbredt, er der ingen klar protokol til direkte omprogrammering til melanocytter. Desuden er antallet af tilgængelige transkriptionsfaktorer overvældende.
Her præsenteres en koncentreret lentivirusemballagesystemprotokol til fremstilling af transkriptionsfaktorer valgt til omprogrammering af hudceller til melanocytter, herunder Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 og Snai2. Museembryonale fibroblaster (MEF’er) blev inficeret med det koncentrerede lentivirus for alle disse transkriptionsfaktorer til direkte omprogrammering af MEF’erne til inducerede melanocytter (iMels) in vitro. Desuden blev disse transkriptionsfaktorer screenet, og systemet blev optimeret til direkte omprogrammering til melanocytter. Ekspressionen af de karakteristiske markører for melanin i iMels på gen- eller proteinniveau blev signifikant forøget. Disse resultater tyder på, at direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter kan være en vellykket ny terapeutisk strategi for vitiligo og bekræfte mekanismen for melanocytudvikling, hvilket vil danne grundlag for yderligere direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter in vivo.
Introduction
Vitiligo er en hudsygdom, der alvorligt påvirker de berørte personers fysiske og mentale sundhed. Af forskellige årsager, herunder metaboliske abnormiteter, oxidativ stress, generering af inflammatoriske mediatorer, celleafløsning og autoimmun respons, går de funktionelle melanocytter tabt, og udskillelsen af melanin stoppes, hvilket fører til udvikling af vitiligo 1,2. Denne tilstand forekommer bredt og er særlig problematisk i ansigtet. Den vigtigste behandling er den systemiske anvendelse af kortikosteroider og immunmodulatorer. Fototerapi kan bruges til systemiske eller lokale sygdomme, og der er kirurgiske behandlinger, såsom perforeret hudtransplantation og autolog melanocyttransplantation 3,4,5. Patienter, der bruger lægemiddelterapi og fototerapi, er imidlertid tilbøjelige til tilbagefald, og disse behandlinger har dårlige langsigtede terapeutiske virkninger. Kirurgisk behandling er traumatisk og kun moderat effektiv 2,6. Derfor er der behov for en ny og effektiv terapeutisk strategi for vitiligo.
Omprogrammeringen af inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) vender disse celler fra deres terminale tilstand til en pluripotent tilstand, en proces medieret af transkriptionsfaktorerne, Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc7. På grund af muligheden for tumorigenicitet og den lange produktionstid er denne teknologi imidlertid blevet mødt med skepsis, når den anvendes på kliniske indstillinger8. Direkte omprogrammering er en teknologi, der får en type terminalcelle til at omdanne til en anden type terminalcelle9. Denne proces opnås ved hjælp af egnede transkriptionsfaktorer. Forskellige celler er allerede blevet direkte omprogrammeret med succes, herunder kardiomyocytter10, neuroner11 og cochlear hårceller12. Nogle forskere har endda omprogrammeret hudvæv direkte in situ, som kan bruges til sårreparation13. Fordelene ved direkte omprogrammering omfatter reducerede ventetider og omkostninger, lavere risiko for kræft, færre etiske problemer og en bedre forståelse af den mekanisme, der ligger til grund for bestemmelse af celleskæbne9.
Selv om den direkte omprogrammeringsmetode anvendes i vid udstrækning, er der i øjeblikket ingen bestemt metode til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter, især på grund af de mange transkriptionsfaktorer, der skal betragtes som14,15. Transkriptionsfaktorerne, Mitf, Sox10 og Pax3, er blevet brugt til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter14. I modsætning hertil er kombinationen af MITF, PAX3, SOX2 og SOX9 også blevet brugt til direkte omprogrammering af hudceller til humane melanocytter i en anden undersøgelse15. I denne protokol blev det samme resultat opnået med kombinationen af Mitf, Sox10 og Pax3 til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter som beskrevet tidligere14. Udvikling af et system til at generere melanocytter fra andre hudceller kan give en ordning for omdannelse af andre hudceller af vitiligo-patienter til melanocytter. Derfor er det afgørende at konstruere en enkel og effektiv metode til denne direkte omprogrammering for at generere melanocytter med succes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virusets kvalitet er afgørende for succesen med direkte omprogrammering til melanocytter i denne protokol. Metoden til emballering og koncentration af vira i denne protokol er enkel og nem at gentage og er ikke afhængig af noget andet hjælpekoncentreret reagens. Denne protokol kan følges med succes i de fleste laboratorier. For at sikre kvaliteten af den koncentrerede virus kræver følgende punkter særlig opmærksomhed. Den ene er cellestatus for HEK-293T. Selvom HEK-293T-celler er udødeliggjorte celler, skal cell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) og Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
- Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
