תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים
Summary
כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.
Abstract
אובדן התפקוד של מלנוציטים מוביל vitiligo, אשר משפיע ברצינות על הבריאות הפיזית והנפשית של האנשים המושפעים. כיום, אין טיפול יעיל לטווח ארוך עבור vitiligo. לכן, זה הכרחי לפתח טיפול נוח ויעיל עבור vitiligo. טכנולוגיית רפואה רגנרטיבית לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים נראית כטיפול חדשני ומבטיח בויטיליגו. זה כרוך בתכנות מחדש ישיר של תאי העור של המטופל למלנוציטים תפקודיים כדי לעזור למתן את אובדן המלנוציטים בחולים עם ויטיליגו. עם זאת, שיטה זו צריכה להיבדק תחילה על עכברים. למרות שתכנות מחדש ישיר נמצא בשימוש נרחב, אין פרוטוקול ברור לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. יתר על כן, מספר גורמי השעתוק הזמינים הוא מכריע.
כאן, פרוטוקול מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus מוצג כדי לייצר גורמי שעתוק שנבחרו לתכנות מחדש של תאי עור למלנוציטים, כולל Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ו- Snai2. פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) נדבקו בנגיף הלנטי המרוכז עבור כל גורמי השעתוק הללו לתכנות מחדש ישיר של ה-MEFs למלנוציטים מושרים (iMels) במבחנה. יתר על כן, גורמי שעתוק אלה נבדקו, והמערכת הותאמה לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. הביטוי של הסמנים האופייניים של מלנין ב- iMels ברמת הגן או החלבון היה מוגבר באופן משמעותי. תוצאות אלה מצביעות על כך שתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים יכול להיות אסטרטגיה טיפולית חדשה ומוצלחת עבור ויטיליגו ולאשר את המנגנון של התפתחות מלנוציטים, אשר יספק את הבסיס לתכנות מחדש ישיר נוסף של פיברובלסטים למלנוציטים in vivo.
Introduction
ויטיליגו היא מחלת עור המשפיעה קשות על בריאותם הגופנית והנפשית של האנשים המושפעים. מסיבות שונות, כולל הפרעות מטבוליות, עקה חמצונית, יצירת מתווכים דלקתיים, ניתוק תאים ותגובה אוטואימונית, המלנוציטים התפקודיים הולכים לאיבוד, והפרשת המלנין נעצרת, מה שמוביל להתפתחות של ויטיליגו 1,2. מצב זה מתרחש באופן נרחב והוא בעייתי במיוחד על הפנים. הטיפול העיקרי הוא שימוש סיסטמי בקורטיקוסטרואידים ובאימונומודולטורים. פוטותרפיה יכולה לשמש למחלות סיסטמיות או מקומיות, וישנם טיפולים כירורגיים, כגון השתלת עור מחורר והשתלת מלנוציטים אוטולוגית 3,4,5. עם זאת, חולים המשתמשים בטיפול תרופתי ובפוטותרפיה נוטים להישנות, ולטיפולים אלה יש השפעות טיפוליות ארוכות טווח גרועות. הטיפול הכירורגי הוא טראומטי ויעיל למדי רק 2,6. לכן, יש צורך באסטרטגיה טיפולית חדשה ויעילה עבור ויטיליגו.
התכנות מחדש של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הופך את התאים האלה ממצבם הסופי למצב פלוריפוטנטי, תהליך המתווך על ידי גורמי השעתוק, Oct4, Sox2, Klf4 ו-c-Myc7. עם זאת, בשל האפשרות של גידולים סרטניים וזמן הייצור הארוך, טכנולוגיה זו נתקלה בספקנות כאשר יושמה על הגדרות קליניות8. תכנות מחדש ישיר הוא טכנולוגיה שגורמת לסוג אחד של תא סופני להפוך לסוג אחר של תא סופני9. תהליך זה מושג על ידי גורמי שעתוק מתאימים. תאים שונים כבר תוכננו מחדש ישירות בהצלחה, כולל קרדיומיוציטים10, נוירונים11 ותאי שיער שבלול12. חלק מהחוקרים אף תיכנתו מחדש את רקמת העור ישירות באתרה, שיכולה לשמש לתיקוןפצעים 13. היתרונות של תכנות מחדש ישיר כוללים זמני המתנה ועלויות מופחתים, סיכון נמוך יותר לסרטן, פחות בעיות אתיות והבנה טובה יותר של המנגנון העומד בבסיס קביעת גורל התא9.
למרות ששיטת התכנות מחדש הישירה נמצאת בשימוש נרחב, אין כיום שיטה מוגדרת לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים, במיוחד בגלל גורמי השעתוק הרבים להיחשב14,15. גורמי השעתוק, Mitf, Sox10 ו-Pax3, שימשו לתכנות מחדש ישיר של תאי העור למלנוציטים14. לעומת זאת, השילוב של MITF, PAX3, SOX2 ו-SOX9 שימש גם לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים אנושיים במחקר אחר15. בפרוטוקול זה, למרות השימוש בשיטת סינון שונה, אותה תוצאה הושגה עם השילוב של Mitf, Sox10 ו- Pax3 לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים כפי שתואר קודם לכן14. פיתוח מערכת ליצירת מלנוציטים מתאי עור אחרים יכול לספק תוכנית להפיכת תאי עור אחרים של חולי ויטיליגו למלנוציטים. לפיכך, חיוני לבנות שיטה פשוטה ויעילה לתכנות מחדש ישיר זה כדי ליצור מלנוציטים בהצלחה.
Protocol
Representative Results
Discussion
איכות הנגיף חיונית להצלחת התכנות מחדש הישיר למלנוציטים בפרוטוקול זה. השיטה של אריזה וריכוז וירוסים בפרוטוקול זה היא פשוטה וקלה לחזרה ואינה מסתמכת על כל מגיב מרוכז עזר אחר. פרוטוקול זה ניתן לעקוב בהצלחה ברוב המעבדות. כדי להבטיח את איכות הנגיף המרוכז, הנקודות הבאות זקוקות לתשומת לב מיוחדת. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070638 ו-81770621) ומהקרן למדעי הטבע של מחוז ג’יאנגסו (BK20180281).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
- Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
