Reprogrammation directe des fibroblastes de souris en mélanocytes

Résumé

Nous décrivons ici un système de reprogrammation directe optimisé pour les mélanocytes et un système d’emballage de virus concentré à haute efficacité qui assure une reprogrammation directe en douceur.

Résumé

La perte de fonction des mélanocytes conduit au vitiligo, qui affecte gravement la santé physique et mentale des personnes touchées. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace à long terme pour le vitiligo. Par conséquent, il est impératif de développer un traitement pratique et efficace pour le vitiligo. La technologie de médecine régénérative pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes semble être un nouveau traitement prometteur du vitiligo. Cela implique la reprogrammation directe des cellules de la peau du patient en mélanocytes fonctionnels pour aider à améliorer la perte de mélanocytes chez les patients atteints de vitiligo. Cependant, cette méthode doit d’abord être testée sur des souris. Bien que la reprogrammation directe soit largement utilisée, il n’existe pas de protocole clair pour la reprogrammation directe en mélanocytes. De plus, le nombre de facteurs de transcription disponibles est écrasant.

Ici, un protocole de système d’emballage de lentivirus concentré est présenté pour produire des facteurs de transcription sélectionnés pour reprogrammer les cellules de la peau en mélanocytes, y compris Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 et Snai2. Des fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris ont été infectés par le lentivirus concentré pour tous ces facteurs de transcription pour la reprogrammation directe des MEF en mélanocytes induits (iMels) in vitro. De plus, ces facteurs de transcription ont été examinés et le système a été optimisé pour une reprogrammation directe en mélanocytes. L’expression des marqueurs caractéristiques de la mélanine dans iMels au niveau du gène ou de la protéine a été significativement augmentée. Ces résultats suggèrent que la reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique réussie pour le vitiligo et confirmer le mécanisme de développement des mélanocytes, ce qui fournira la base d’une reprogrammation directe ultérieure des fibroblastes en mélanocytes in vivo.

Introduction

Le vitiligo est une maladie de la peau qui affecte gravement la santé physique et mentale des personnes touchées. Pour diverses raisons, y compris les anomalies métaboliques, le stress oxydatif, la génération de médiateurs inflammatoires, le détachement cellulaire et la réponse auto-immune, les mélanocytes fonctionnels sont perdus et la sécrétion de mélanine est arrêtée, conduisant au développement du vitiligo ^1,2. Cette condition se produit largement et est particulièrement problématique sur le visage. Le traitement principal est l’utilisation systémique de corticostéroïdes et d’immunomodulateurs. La photothé....

Protocole

Ce travail a été approuvé par le Comité de gestion et d’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université du Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Les expériences ont été réalisées en stricte conformité avec les normes établies par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Il n’y a pas eu d’expériences impliquant des humains, donc ce travail n’a pas eu besoin de l’approbation du comité d’éthique de la recherche humaine. Reportez-vous à la Table des matériaux pour plus de détails sur les réactifs.

1. Construction d’un système d’emballage de lentivirus con....

Résultats

Cet article comprend les protocoles d’un système d’emballage de lentivirus concentré pour produire le lentivirus des facteurs de transcription pour la reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes et les protocoles pour le dépistage des facteurs de transcription et la reprogrammation directe des mélanocytes à partir de MEF.

Le succès de la production de lentivirus concentré a été évalué en observant l’intensité de fluorescence de la GFP (Figure 1A) ou pa.......

Discussion

La qualité du virus est cruciale pour le succès de la reprogrammation directe en mélanocytes dans ce protocole. La méthode d’emballage et de concentration des virus dans ce protocole est simple et facile à répéter et ne repose sur aucun autre réactif concentré auxiliaire. Ce protocole peut être suivi avec succès dans la plupart des laboratoires. Pour garantir la qualité du virus concentré, les points suivants nécessitent une attention particulière. L’un est le statut cellulaire de HEK-293T. Bien que les cellules HEK-293T.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % trypsine-EDTA	Gibco	25300-062	stocké à -20 ° ; C
0,45 &mu ; Filtre	M Millipore	SLHVR33RB
5 mL polystyrène tube à fond rond	Falcon	352052
95 %/100 % éthanol	LANBAO	210106	Stocké chez RT
Adenine	Sigma	A2786	Concentration stock 40 mg/mL Concentration finale 24 µ ; g/mL
Alexa Fluor 555 Chèvre anti-souris IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilution de 1:500 pour l’utilisation d’antibiotiques
(Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Stocké à -20 ° ; C
Anticorps anti-TRP1/TYRP1	Millipore	MABC592	Hôte/Isotype : Souris IgG2a Réactivité de l’espèce : Souris/Humain Dilution de 1:200 pour utiliser l’anticorps
anti-TRP2/DCT	Abcam	ab74073	Hôte/Isotype : Lapin IgG Réactivité de l’espèce : Souris/Humain Dilution de 1:200 pour utiliser
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Concentration de stock 10 mM Final Concentration 3 &mu ; M
Toxine cholérique	Sigma	C8052	Concentration stock 0,3 mg/mL Concentration finale 20 pM
Cy3 Chèvre anti-Lapin IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilution de 1:500 pour utiliser
DMEM (High glucose)	HyClone	SH30243.01	Stocké à 4 ° ; C
DMSO  ;	Sigma	D2650	stocké chez RT
FBS	Gibco	10270-106	stocké à -20 ° ; C Inactivé à la chaleur avant utilisation
Gélatine	Sigma	G9391	Stocké dans les
plasmides RT GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 et Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Stocké à -20 ° ; C
Hématoxyline	Abcam	ab220365	Stocké à RT
Human EDN3	American-Peptide	88-5-10A	Concentration de stock 100 &mu ; M Concentration finale 0,1 &mu ; M
Hydrocortisone	Sigma	H0888	Concentration de stock 100 µ ; g/mL Concentration finale 0,5 & micro ; g/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	Stocké à RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Réactif de transfection, stocké à 4 ° ; C
Masson-Fontana kit de coloration	Solarbio	G2032	Stocké à 4 ° ; C
Baume neutre	Solarbio	G8590	Stocké à 4 ° ; C
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148	Stocké chez RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Stocké chez RT
Phorbol 12-myristate 13-acétate (TPA)	Sigma	P8139	Concentration de stock 1 mM Concentration finale 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	réactif de transfection polymérique cationique ; Concentration du stock 8 &mu ; g/µ ; L Concentration finale 4 ng/µ ; L
Puromycin	Gibco	A11138-03	stocké à -20 ° ; C
BFGF humain recombinant	Invitrogen	13256-029	Concentration de stock 4 &mu ; g/mL Concentration finale 10 ng/mL
Insuline humaine recombinante	Sigma  ;	I3536	Concentration de matière première 10 mg/mL Concentration finale 5 & micro ; g/mL
FCC humain recombinant	R& D	255-SC-010	Concentration du stock 200 &mu ; g/mL Concentration finale 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Stocké à 4 ° ; C
Xylene	Sigma	1330-20-7	stocké chez RT

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