インビトロで心臓虚血/再灌流を模倣する細胞共培養モデルの開発
Summary
空間距離は、別々の内皮細胞層と心筋細胞層の共培養モデルにおける低酸素/再酸素化傷害を評価する際の重要なパラメータであり、心筋細胞保護における内皮細胞の役割を試験するための好ましい in vitro モデルを提供するためには、共培養空間環境を最適化する必要があることを初めて示唆する。
Abstract
虚血性心疾患は、世界中の主要な死因および障害である。再灌流は虚血を超えてさらなる傷害を引き起こす。内皮細胞(EC)は、細胞間相互作用を介して心筋細胞(CM)を再灌流傷害から保護することができる。共培養は、細胞間相互作用の役割を調査するのに役立ちます。混合共培養は最も単純なアプローチですが、単一細胞型の単離処理および下流分析は実現不可能であるため、制限されています。ECがCM細胞損傷を用量依存的に減弱させることができるかどうか、およびこの保護が2つの細胞株間の接触距離を変えることによってさらに最適化され得るかどうかを調べるために、我々はマウス原発性冠状動脈内皮細胞および成体マウス心筋細胞を使用して、細胞間層間距離が0.5で変化した3種類の細胞培養インサートを試験した。 それぞれ1.0、および2.0mm。CMsのみでは、乳酸脱水素酵素(LDH)放出によって評価された細胞傷害は、低酸素状態の間、およびさらに再酸素化時に、距離が0.5および1.0mmと比較して2.0mmであったときに有意に増加した。ECとCMがほぼ直接接触していたとき(0.5mm)、低酸素症後のCMの再酸素化傷害の軽度の減衰しかなかった。この減衰は、空間距離が1.0mmのときに有意に増加した。2.0mmの距離では、ECは低酸素および低酸素/再酸素化の両方でCM傷害を減衰させ、ECがCMとクロストークするために十分な培養距離が必要であることを示し、分泌されたシグナル分子が循環し、保護経路を完全に刺激することができる。我々の知見は、EC/CM共培養空間環境を最適化することが、模擬虚血/再灌流傷害に対するCM保護におけるECの役割を試験するための好ましい in vitro モデルを提供するために必要であることを初めて示唆する。このレポートの目標は、研究者がこの重要なモデルを有利に活用するための段階的なアプローチを提供することです。
Introduction
虚血性心疾患は、世界中の死因および障害の主要な原因である1,2。しかし、再灌流の治療プロセスは、それ自体が心筋虚血/再灌流(IR)傷害として知られる心筋細胞死を引き起こす可能性があり、有効な治療法はまだない3。内皮細胞(EC)は、パラクリンシグナルの分泌、ならびに細胞間相互作用を通じて心筋細胞(CM)を保護することが示唆されている4。
細胞共培養モデルは、細胞機能および分化に対するオートクリンおよび/またはパラクリン細胞間相互作用の役割を調査するために広く使用されてきた。共培養モデルの中で、混合共培養が最も単純であり、2つの異なるタイプの細胞が所望の細胞比5で単一の培養区画内で直接接触している。しかし、細胞型間の別々の処理と単一の細胞型の下流分析は、混合集団を考えると容易には実現不可能である。
以前の研究では、低酸素および虚血性の侮辱が、乳酸脱水素酵素(LDH)の放出によって測定される細胞膜の完全性に重大な損傷を引き起こすことが示された。この傷害は、再酸素化時に悪化し、再灌流傷害を模倣する6、7、8。現在のプロトコルの目的は、ECの存在が低酸素および再酸素化(HR)によって引き起こされるCMの細胞膜漏出を用量依存的に減弱させることができ、ECの保護効果は2つの細胞株間の接触距離を変えることによって最適化できるという仮説を検証することであった。そこで、マウス初代冠動脈内皮細胞と成体マウス心筋細胞の3種類の細胞培養インサートを採用した。コーニング、メルクミリポア、グライナーバイオワンによってブランド化されたインサートは、細胞間ライン間距離がそれぞれ0.5、1.0、および2.0mmの3つの異なる細胞培養クロストーク条件を作成することができました。各ケースでインサートあたり100,000個のECがメッキされました。
さらに、このモデルにおいて、共培養中のECの密度がHR傷害減弱に寄与するかどうかを決定するために、我々は、EC濃度とCMによるLDH放出との間の用量反応関係を研究した。
このレポートは、研究者がこの重要なモデルを有利に利用するための段階的なアプローチを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの重要なステップ
細胞共培養モデルは、心臓保護の細胞機構を研究するために使用されてきた。したがって、それらの間に意味のある距離を持つ2つの別々のレイヤーを作成する方法は、適切な共同文化モデルの開発にとって非常に重要です。シミュレートされたIR、すなわちHR、傷害を研究する際の課題は、虚血(低酸素症)自体だけでなく、再灌流(再酸素化)も細胞?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、部分的には、米国退役軍人省生物医学研究所R&Dサービス(I01 BX003482)とM.L.R.への機関資金によって支援されました。
Materials
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
References
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