Udvikling af en cellekokulturmodel til efterligning af hjerteiskæmi /reperfusion in vitro

Summary

Rumlig afstand er en nøgleparameter i vurderingen af hypoxi / reoxygeneringsskade i en co-kulturmodel af separate endotel- og kardiomyocytcellelag, hvilket for første gang tyder på, at optimering af co-kulturens rumlige miljø er nødvendig for at tilvejebringe en gunstig in vitro-model til test af endotelcellernes rolle i kardiomyocytbeskyttelse.

Abstract

Iskæmisk hjertesygdom er den førende dødsårsag og handicap på verdensplan. Reperfusion forårsager yderligere skade ud over iskæmi. Endotelceller (ECs) kan beskytte kardiomyocytter (PM’er) mod reperfusionsskade gennem celle-celleinteraktioner. Co-kulturer kan hjælpe med at undersøge rollen som celle-celle interaktioner. En blandet co-kultur er den enkleste tilgang, men er begrænset, da isolerede behandlinger og downstream-analyser af enkeltcelletyper ikke er mulige. For at undersøge, om EU’er kan dosisafhængigt dæmpe CM-celleskader, og om denne beskyttelse kan optimeres yderligere ved at variere kontaktafstanden mellem de to cellelinjer, brugte vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells og Adult Mouse Cardiomyocytes til at teste tre typer cellekulturindsatser, der varierede i deres intercellelagsafstand ved 0,5, Henholdsvis 1,0 og 2,0 mm. Kun ved CMs steg cellulær skade som vurderet ved laktatdehydrogenase (LDH) frigivelse signifikant under hypoxi og yderligere ved reoxygenering, når afstanden var 2,0 mm sammenlignet med 0,5 og 1,0 mm. Når EC’er og PM’er var i næsten direkte kontakt (0,5 mm), var der kun en mild dæmpning af CM’ernes reoxygeneringsskade efter hypoxi. Denne dæmpelse blev signifikant øget, når den rumlige afstand var 1,0 mm. Med en afstand på 2,0 mm dæmpede ECs CM-skade under både hypoxi og hypoxi/reoxygenering, hvilket indikerer, at tilstrækkelig kulturafstand er nødvendig for, at EC’er kan krydstale med CM’er, således at udskillede signalmolekyler kan cirkulere og fuldt ud stimulere beskyttelsesveje. Vores resultater tyder for første gang på, at optimering af EF/CM-samkulturens rumlige miljø er nødvendig for at tilvejebringe en gunstig in vitro-model til test af EC’ernes rolle i CM-beskyttelse mod simuleret iskæmi/reperfusionsskade. Målet med denne rapport er at give en trinvis tilgang for efterforskere til at bruge denne vigtige model til deres fordel.

Introduction

Iskæmisk hjertesygdom er den største dødsårsag og handicap på verdensplan ^1,2. Imidlertid kan behandlingsprocessen for reperfusion i sig selv forårsage kardiomyocytdød, kendt som myokardieiskæmi / reperfusion (IR) skade, for hvilken der stadig ikke er noget effektivt middel³. Endotelceller (EC’er) er blevet foreslået at beskytte kardiomyocytter (PM’er) gennem udskillelse af parakrine signaler samt celle-til-celle-interaktioner⁴.

Celle-co-kultur modeller er blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge rollen autokrine og / eller parakrine celle-celle interaktioner på cellefunktion og differentiering. Blandt co-kulturmodeller er blandet co-kultur den enkleste, hvor to forskellige typer celler er i direkte kontakt inden for et enkelt kulturrum ved et ønsket celleforhold⁵. Imidlertid er separate behandlinger mellem celletyper og downstream-analyse af en enkelt celletype ikke let gennemførlige i betragtning af den blandede population.

Tidligere undersøgelser viste, at hypoxiske og iskæmiske fornærmelser forårsager betydelig skade på cellemembranens integritet målt ved frigivelse af laktatdehydrogenase (LDH). Denne skade forværres ved reiltning, efterligner reperfusionsskade ^6,7,8. Målet med den nuværende protokol var at teste hypoteserne om, at tilstedeværelsen af EC’er kan dosisafhængigt dæmpe cellemembranlækage af PM’er forårsaget af hypoxi og reoxygenering (HR), og at den beskyttende virkning af ECs kan optimeres ved at variere kontaktafstanden mellem de to cellelinjer. Således anvendte vi tre typer cellekulturindsatser og Musens primære koronararterieendotelceller og voksne muskardiomyocytter. Indsatserne, mærket af Corning, Merck Millipore og Greiner Bio-One, tillod os at skabe tre forskellige cellekultur crosstalk-betingelser med intercellelinjeafstande på henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm. 100.000 PC’er blev belagt pr. indsats i hvert tilfælde.

For at afgøre, om tætheden af EC’er i co-kultur bidrager til hr-skadedæmpning i denne model, undersøgte vi desuden dosis-respons-forholdet mellem EF-koncentration og LDH-frigivelse ved CM’er. EC’er blev belagt med henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 pr. indsats i 2,0 mm-indsatsen.

Denne rapport giver en trinvis tilgang for efterforskere til at bruge denne vigtige model til deres fordel.

Protocol

1. Eksperimentel forberedelse/plettering Vedligehold PM’er og PC’er i henhold til producentens anvisninger. Tø begge cellelinjer op, når de ankommer fra leverandører. Plade i T25-kolber efter at være blevet vasket med friske medier. Det anbefales at købe hvert cellekulturmedie fra de samme leverandører, som cellerne blev købt fra. Den næste dag skal du opdatere cellerne med medier og bruge dem, når de er sammenflydende. Oprethold cellekulturinkubatoren ved 37 ° C me…

Representative Results

Alle tre typer indsatser (A, B, C), der anvendes i dette eksperiment, har samme porestørrelse på 0,4 μm. Den eneste forskel mellem dem er insert-to-base-højden, som gør det muligt for afstande mellem de to samkulturelle cellelag at være henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm (figur 3), og at de er fra forskellige leverandører (for detaljer se Tabel over materialer). For at etablere en in vitro-co-kulturmodel med separate lag af to cellelin…

Discussion

Kritiske trin i protokollen
Celle co-kultur modeller er blevet brugt til at studere cellulære mekanismer for kardiobeskyttelse. Hvordan man skaber to separate lag med en meningsfuld afstand mellem dem, er således afgørende for udviklingen af en passende co-kulturmodel. En udfordring ved at studere simuleret IR, dvs. HR, skade er, at ikke kun iskæmi (hypoxi) selv, men også reperfusion (reoxygenering) forværrer cellulær dysfunktion. Derfor skal en realistisk model afspejle disse egenskaber ved f….

Materials

Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested