Utvikling av en celle co-kultur modell for å etterligne hjerte iskemi / reperfusjon in vitro

Summary

Romlig avstand er en nøkkelparameter for å vurdere hypoksi / reoksygeneringsskade i en samkulturmodell av separate endotel- og kardiomyocyttcellelag, noe som for første gang antyder at optimalisering av samkulturens romlige miljø er nødvendig for å gi en gunstig in vitro-modell for å teste rollen som endotelceller i kardiomyocyttbeskyttelse.

Abstract

Iskemisk hjertesykdom er den ledende årsaken til død og funksjonshemming over hele verden. Reperfusjon forårsaker ytterligere skade utover iskemi. Endotelceller (ECer) kan beskytte kardiomyocytter (CMs) mot reperfusjonsskade gjennom cellecelleinteraksjoner. Samkulturer kan bidra til å undersøke rollen som cellecelleinteraksjoner. En blandet samkultur er den enkleste tilnærmingen, men er begrenset ettersom isolerte behandlinger og nedstrømsanalyser av enkeltcelletyper ikke er gjennomførbare. For å undersøke om ECer kan doseavhengig dempe CM-celleskade og om denne beskyttelsen kan optimaliseres ytterligere ved å variere kontaktavstanden mellom de to cellelinjene, brukte vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells og Adult Mouse Cardiomyocytes for å teste tre typer cellekulturinnlegg som varierte i deres intercellede lagavstand ved 0,5, henholdsvis 1,0 og 2,0 mm. Kun ved CMs økte cellulær skade som vurdert ved laktat dehydrogenase (LDH) frigjøring betydelig under hypoksi og videre ved reoksygenering når avstanden var 2,0 mm sammenlignet med 0,5 og 1,0 mm. Når ECs og CMs var i nesten direkte kontakt (0,5 mm), var det bare en mild demping av reoksygeneringsskaden til CMs etter hypoksi. Denne dempingen ble betydelig økt når den romlige avstanden var 1,0 mm. Med 2,0 mm avstand svekket ECs CM-skade under både hypoksi og hypoksi/reoksygenering, noe som indikerer at tilstrekkelig kulturavstand er nødvendig for at ECs skal krysstale med CMs, slik at utskilte signalmolekyler kan sirkulere og fullt stimulere beskyttende veier. Våre funn tyder for første gang på at optimalisering av det romlige miljøet i EC/CM-kokulturen er nødvendig for å gi en gunstig in vitro-modell for å teste ECs rolle i CM-beskyttelse mot simulert iskemi/reperfusjonsskade. Målet med denne rapporten er å gi en trinnvis tilnærming for etterforskere å bruke denne viktige modellen til sin fordel.

Introduction

Iskemisk hjertesykdom er den ledende dødsårsaken og funksjonshemmingen over hele verden ^1,2. Imidlertid kan behandlingsprosessen for reperfusjon selv forårsake kardiomyocyttdød, kjent som myokardisk iskemi / reperfusjonsskade (IR), som det fortsatt ikke er noe effektivt middel³ for. Endotelceller (ECs) har blitt foreslått å beskytte kardiomyocytter (CMs) gjennom sekresjon av parakrine signaler, samt celle-til-celle interaksjoner⁴.

Cellekokulturmodeller har blitt brukt mye for å undersøke rollen som autocrine og / eller parakrine cellecelleinteraksjoner på cellefunksjon og differensiering. Blant samkulturmodeller er blandet samkultur den enkleste, der to forskjellige typer celler er i direkte kontakt i et enkelt kulturrom med ønsket celleforhold⁵. Separate behandlinger mellom celletyper og nedstrømsanalyse av en enkelt celletype er imidlertid ikke lett mulig gitt den blandede populasjonen.

Tidligere studier indikerte at hypoksiske og iskemiske fornærmelser forårsaker betydelig skade på integriteten til cellemembranen målt ved frigjøring av laktatdehydrogenase (LDH). Denne skaden forverres ved reoksygenering, og etterligner reperfusjonsskade ^6,7,8. Målet med den nåværende protokollen var å teste hypotesene om at tilstedeværelsen av ECs kan doseavhengig dempe cellemembranlekkasje av CMs forårsaket av hypoksi og reoksygenering (HR) og at den beskyttende effekten av ECs kan optimaliseres ved å variere kontaktavstanden mellom de to cellelinjene. Dermed brukte vi tre typer cellekulturinnlegg og Mus Primær Koronar Arterie Endotelceller og Voksen Mus Kardiomyocytter. Innsatsene, merket av Corning, Merck Millipore og Greiner Bio-One tillot oss å lage tre forskjellige cellekultur-krysstaleforhold med intercellede linjeavstander på henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm. 100 000 ECer ble belagt per innsats i hvert tilfelle.

For å finne ut om tettheten av ECs i samkultur bidrar til HR-skadedemping i denne modellen, studerte vi doseresponsforholdet mellom EC-konsentrasjon og LDH-frigjøring av CMs. ECs ble belagt med henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 per innsats.

Denne rapporten gir en trinnvis tilnærming for etterforskere til å bruke denne viktige modellen til sin fordel.

Protocol

1. Eksperimentell forberedelse/plating Vedlikehold CMer og ECer i henhold til produsentens instruksjoner. Tine begge cellelinjene når de kommer fra leverandører. Plate i T25 kolber etter å ha blitt vasket med friske medier. Det anbefales å kjøpe hvert cellekulturmedie fra de samme leverandørene som cellene ble kjøpt fra. Neste dag oppdaterer du cellene med medier og bruker dem sammen. Vedlikehold cellekulturinkubatoren ved 37 °C med 21 % O2, 5 % CO2</s…

Representative Results

Alle tre typer innsatser (A, B, C) som brukes i dette eksperimentet har samme porestørrelse på 0,4 μm. Den eneste forskjellen mellom dem er innsats-til-grunn-høyden, som gjør at avstandene mellom de to samkulturerte cellelagene er henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm (figur 3) og at de er fra forskjellige leverandører (for detaljer se Tabell over materialer). For å etablere en in vitro-samkulturmodell med separate lag med to cellelinjer …

Discussion

Kritiske trinn i protokollen
Cellekokulturmodeller har blitt brukt til å studere cellulære mekanismer for kardiobeskyttelse. Hvordan lage to separate lag med en meningsfull avstand mellom dem er derfor avgjørende for utviklingen av en passende samkulturmodell. En utfordring med å studere simulert IR, det vil si HR, skade er at ikke bare iskemi (hypoksi) selv, men også reperfusjon (reoksygenering) forverrer cellulær dysfunksjon. Derfor må en realistisk modell reflektere disse egenskapene ved for…

Materials

Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested