Bestemmelse af mitokondrie respiration og glykolyse i Ex Vivo Retinal vævsprøver

Summary

Beskrevet her er en detaljeret protokol for udførelse mitokondrie stress assay og glykolytisk sats assay i ex vivo retinal væv prøver ved hjælp af en kommerciel bioanalyzer.

Abstract

Mitokondrie respiration er en kritisk energi-genererende vej i alle celler, især retinale fotoreceptorer, der besidder en meget aktiv metabolisme. Derudover udviser fotoreceptorer også høj aerob glykolyse som kræftceller. Præcise målinger af disse metaboliske aktiviteter kan give værdifuld indsigt i cellulære homøostase under fysiologiske forhold og i sygdomstilstande. Høj gennemløb mikroplade-baserede assays er blevet udviklet til at måle mitokondrie respiration og forskellige metaboliske aktiviteter i levende celler. Langt de fleste af disse er imidlertid udviklet til kultiverede celler og er ikke blevet optimeret til intakte vævsprøver og til påførings ex vivo. Beskrevet her er en detaljeret trin-for-trin protokol, ved hjælp af mikroplade-baseret fluorescens teknologi, til direkte at måle iltforbrug sats (OCR) som en indikator for mitokondrie respiration, samt ekstracellulær forsuring sats (ECAR) som en indikator for glykolyse, i intakt ex vivo retinal væv. Denne metode er blevet brugt til at vurdere metaboliske aktiviteter i voksne mus nethinden og demonstrere dens anvendelse i at undersøge cellulære mekanismer af aldring og sygdom.

Introduction

Mitokondrier er essentielle organelle, der regulerer cellulære metabolisme, signalering, homøostase, og apoptose ved at koordinere flere afgørende fysiologiske ^processer1. Mitokondrier tjene som kraftcenter i cellen til at generere adenosin triphosphat (ATP) gennem oxidativ fosforylering (OXPHOS) og give energi, der understøtter næsten alle cellulære begivenheder. Størstedelen af cellulær ilt metaboliseres i mitokondrier, hvor det tjener som den endelige elektron acceptor i elektron transportkæden (ETC) under aerob respiration. Lave mængder ATP kan også fremstilles af glykolyse i cytosolen, hvor glukose omdannes til pyruvat, som yderligere kan omdannes til laktat eller transporteres til mitokondrier og oxideres til acetyl-CoA, et substrat i tricarboxylsyrecyklussen (TCA-cyklus).

Nethinden er en af de mest metabolisk aktive væv i ^pattedyr2, viser høje niveauer af mitokondrie respiration og ekstremt højt ^iltforbrug3. Stangen og kegle fotoreceptorer indeholder en høj densitet af mitokondrier4, og OXPHOS genererer de fleste ATP i ^nethinden5. Derudover er nethinden også stærkt afhængig af aerob glykolyse6,7 ved at konvertere glukose til laktat5. Mitokondrie defekter er forbundet med forskellige neurodegenerative ^sygdomme8,9; og med sine unikke høje energibehov er nethinden særligt sårbar over for metaboliske defekter, herunder dem, der påvirker mitokondrie ^OXPHOS4 og glykolyse10. Mitokondrie dysfunktion og defekter i glykolyse er impliceret i ^retinal11,12 og ^makula13 degenerative sygdomme, aldersrelaterede makuladegeneration10,14,15,16, og diabetisk retinopati17,18. Derfor kan nøjagtige målinger af mitokondrie respiration og glykolyse give vigtige parametre til vurdering af nethindens integritet og sundhed.

Mitokondrie respiration kan måles ved bestemmelse af iltforbrug sats (OCR). Da omdannelsen af glukose til pyruvat og efterfølgende til laktat resulterer i ekstrudering af protoner til og forsuring af det ekstracellulære miljø, giver målinger af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) en indikation af glykolysestrøm. Da nethinden består af flere celletyper med intime relationer og aktiv synergi, herunder udveksling af ^substrater6, er det bydende nødvendigt at analysere mitokondriefunktion og metabolisme i forbindelse med hele retinal væv med intakt laminering og kredsløb. I de sidste mange årtier er Clark type _O2 elektroder og andre iltmikroelektroder blevet brugt til at måle iltforbruget i nethinden19,20,21. Disse iltelektroder har store begrænsninger i følsomhed, krav om et stort prøvevolumen og behovet for kontinuerlig omrøring af suspenderende prøve, hvilket normalt fører til afbrydelse af cellulær og vævskontekst. Protokollen beskrevet her blev udviklet ved hjælp af en mikroplade-baseret, fluorescens teknik til at måle mitokondrie energi metabolisme i frisk dissekeret ex vivo mus nethinden væv. Det giver mulighed for mid-throughput real-time målinger af både OCR og ECAR samtidig ved hjælp af en lille prøve (1 mm punch) af ex vivo retinal væv og samtidig undgå behovet for suspension og kontinuerlig omrøring.

Demonstreret her er den eksperimentelle procedure for mitokondrie stress assay og glykolytisk sats assay på frisk dissekeret retinal punch diske. Denne protokol gør det muligt at måle mitokondrier-relaterede metaboliske aktiviteter i en ex vivo væv sammenhæng. Forskellig fra de analyser, der udføres ved hjælp af kultiverede celler, afspejler de aflæsninger, der opnås her, kombineret energimetabolisme på vævsniveau og påvirkes af interaktioner mellem de forskellige celletyper i vævet. Protokollen er ændret fra en tidligere offentliggjort ^version22,23 for at tilpasse sig den nye generation af Agilent Seahorse ekstracellulær flux 24-brønde (XFe24) analysator med Islet Capture plade. Analysen medium, injektion sammensatte koncentrationer, og antallet / varigheden af assay cyklusser er også blevet optimeret til nethindevæv. En detaljeret trin-for-trin protokol er givet til udarbejdelse af retinale punch diske. Mere information om programopsætning og dataanalyse kan fås ved henvendelse til producentens brugervejledning24,25,26.

Protocol

Alle museprotokoller blev godkendt af Udvalget for Dyrepleje og Anvendelse under National Eye Institute (NEI ASP# 650). Mus blev anbragt i 12 h lyse mørke forhold og plejet ved at følge anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr, Institute of Laboratory Animal Resources og Public Health Service Policy on Human Care and Use of Laboratory Animals. 1. Fugtgivende sensorpatron og tilberedning af analysemediet Dagen før eksperimentet tilsættes 1 mL kalibreringsm…

Representative Results

De data, der er rapporteret her, er repræsentativ mitokondriestresanalyse, der viser OCR-spor (figur 1) og glykolytisk satsanalyse, der viser OCR-spor og ECAR-spor (figur 2), som blev udført ved hjælp af frisk dissekerede 1 mm retinale punch diske fra 4 måneder gamle transgene Nrl-L-EGFP mus36 (C57B/L6 baggrund). Disse mus udtrykker GFP specifikt i stang fotoreceptorer uden at ændre normal retinal udvikling, histologi, og fy…

Discussion

Forudsat her er detaljerede instruktioner til udførelse af mikroplade-baserede analyser af mitokondrie respiration og glykolyse aktivitet ved hjælp af ex vivo, frisk dissekeret retinal punch diske. Protokollen er optimeret til: 1) sikre brugen af et egnet analysemedium til ex vivo retinal væv; 2) anvende korrekt størrelse af retinale punch diske til at opnå OCR og ECAR aflæsninger, der falder inden for maskinens optimale detektionsområde; 3) belægning mesh skær for at forbedre klæbeevnen af re…

Materials

1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution	Sigma	D6134	Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM stock solution	Sigma	A8674	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution	TimTec	ST056388	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Curved tip
Dissection microscope
DMSO	Sigma	D2438
Graefe forceps	Fine Science Tools	11051-10	Curved, Serrated tip
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	Curved tip
NaOH solution, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution	Sigma	R8875	Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM medium	Agilent	103575-100	pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak	Agilent	103518-100	Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer	Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush	Ted Pella	113