Denne protokol skitserer trinene til inducering af primet mykobakteriel uveitis (PMU) hos mus. Denne metode skitserer trinene til at hjælpe med at producere pålidelig og robust okulær betændelse i musemodelsystemet. Ved hjælp af denne protokol genererede vi uveitiske øjne og ubetændte medøjne fra enkeltdyr til yderligere evaluering med immunologiske, transkriptomiske og proteomiske assays.
Udtrykket ‘uveitis’ beskriver et heterogent sæt tilstande, der alle har intraokulær inflammation. Generelt er uveitis defineret af ætiologi: infektion eller autoimmunitet. Infektiøs uveitis kræver behandling med de relevante antimikrobielle midler, mens autoimmun uveitis kræver behandling med kortikosteroider eller andre immunsuppressive midler. Post-infektiøs uveitis er en form for kronisk uveitis, der kræver kortikosteroider for at kontrollere immun sequela efter den første infektion. Uveitis forbundet med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infektion er en velkendt form for post-infektiøs uveitis, men sygdomsmekanismerne forstås ikke fuldt ud. For at forstå den rolle, mykobakterielle antigener og medfødte ligander spiller i stimulering af kronisk okulær inflammation efter mTB-infektion, blev modellen Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) udviklet til brug i mus. Dette manuskript skitserer metoderne til generering af PMU og overvågning af det kliniske forløb af inflammation ved hjælp af farvefundus og optisk kohærenstomografi (OCT) billeddannelse. PMU induceres ved immunisering med varmedræbt mykobakterielt ekstrakt efterfulgt af intravitreal injektion af det samme ekstrakt i det ene øje syv dage senere. Okulær inflammation overvåges i længderetningen ved hjælp af in vivo-billeddannelse og efterfølges af prøveindsamling til en bred vifte af assays, herunder histologi, flowcytometri, cytokinanalyse, qPCR eller mRNA-sekventering. Musemodellen af PMU er et nyttigt nyt værktøj til at studere de okulære reaktioner på mTB, mekanismen for kronisk uveitis og til prækliniske effektivitetstest af nye antiinflammatoriske terapier.
Udtrykket ‘uveitis’ beskriver et heterogent sæt tilstande, der alle har intraokulær inflammation1. Dyremodeller af uveitis er vigtige for at forstå sygdomsmekanismer og for præklinisk test af nye terapier. Der er etableret en række dyremodeller af uveitis2. De to, der er blevet undersøgt mest omfattende, er eksperimentel autoimmun uveitis (eller uveoretinitis; EAU) og endotoksininduceret uveitis (EIU). EAU genereres typisk ved immunisering med okulære antigener eller kan forekomme spontant, når central tolerance forstyrres i fravær af AIRE-genet 3,4. Andre varianter af modellen er siden blevet udviklet 5,6,7 til at omfatte forskellige uveitogene peptider; disse er blevet gennemgået grundigt 8,9,10. EAU er den primære model for former for T-celleafhængig autoimmun uveitis såsom Vogt-Koyanagi-Harada sygdom og birdshot chorioretinitis hos mennesker. EIU genereres ved systemisk eller lokal injektion af bakterielt lipopolysaccharid (LPS)10,11. EIU er blevet brugt som en model for akut uveitis genereret ved aktivering af medfødte immunsignaleringsveje12. Begge modeller har været medvirkende til den nuværende forståelse af okulær immunologi, men ingen af dem er effektive modeller for post-infektiøs kronisk uveitis. For nylig etableret hos mus, giver Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) -modellen nu en tilgang til at forhøre og evaluere kliniske og cellulære aspekter af denne form for uveitis13.
Der er en høj forekomst af mykobakteriel infektion på verdensplan med over 10 millioner nye tilfælde og mere end 1,4 millioner dødsfald rapporteret af Verdenssundhedsorganisationen i 201914. Ekstrapulmonal manifestation af aktiv tuberkulose (TB) infektion omfatter uveitis og er en velkendt årsag til infektiøs uveitis15,16. Manifestationerne af TB-associeret uveitis er protean, hvilket sandsynligvis afspejler flere forskellige sygdomsmekanismer til at omfatte direkte okulær infektion samt mindre forstået immunmedieret inflammation17,18,19. De foreslåede mekanismer for disse postinfektiøse følgevirkninger omfatter et kronisk inflammatorisk respons stimuleret af persistensen af en pauci-bacillær infektion i retinal pigmentepitel (RPE), et kronisk inflammatorisk respons stimuleret af tilstedeværelsen af resterende patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP’er) fra en vellykket ryddet okulær infektion og uhensigtsmæssig aktivering af det adaptive immunrespons mod okulære antigener gennem en proces med molekylær efterligning eller antigen spredning forårsaget af systemisk TB-infektion20,21,22,23.
For at få en bedre mekanistisk forståelse af kronisk postinfektiøs uveitis og studere mykobakterielle antigeners rolle i initiering af sygdom, blev PMU-modellen udviklet til brug hos mus13,24. For at fremkalde betændelse modtager musen derfor først en subkutan injektion af antigen fra den varmedræbte Mycobacterium tuberculosis H37Ra-stamme for at efterligne systemisk infektion, efterfulgt syv dage senere af intravitreal injektion af det samme antigen administreret til venstre eller højre øje for at efterligne lokal okulær infektion. Intensiteten og varigheden af den efterfølgende uveitis overvåges ved langsgående in vivo optisk kohærenstomografi (OCT) og fundal billeddannelse af øjet25. PMU er kendetegnet ved en akut, myeloid-dominerende panuveitis, der udvikler sig til en kronisk T-celle-dominerende posterior uveitis med vitritis, perivaskulær retinal inflammation og fokusområder af ydre retinal skade26. Tilstedeværelsen af granulomatøs inflammation i det bageste segment af øjet tyder på, at PMU-modellen kan bruges til at studere nogle former for anterior (granulomatøs og ikke-granulomatøs) og mellemliggende uveitis, set hos patienter med immunologiske beviser for tidligere Mtb-infektion27. Derudover er komponenterne i varmedræbt Mtb, der anvendes i PMU-modellen, blevet foreslået at udløse immunresponser, der ligger til grund for aspekterne af tilbagevendende uveitis hos patienter med okulær tuberkulose, der reagerer på anti-tuberkulær terapi (ATT)28. På grund af forskellene i sygdomsinitiering og inflammatorisk forløb sammenlignet med EAU og EIU repræsenterer PMU en ny dyremodel for uveitis, der ikke er afhængig af immunisering med okulære antigener og kan hjælpe med at belyse sygdomsmekanismer hos patienter med kronisk uveitis. Denne protokol skitserer metoderne til generering af PMU, overvågning af det kliniske forløb af inflammation og indsamling af okulære prøver til post mortem-analyse med flowcytometri.
Dyremodeller af uveitis har været medvirkende til at forstå mekanismerne for okulær inflammation og homeostase samt muliggøre præklinisk evaluering af medicinske og kirurgiske terapier til patienter med uveitis37. Både kanin- og rottevarianter af PMU-modellen har vist deres værdi i præklinisk behandling via proof of concept-studier38,39,40. På grund af tilgængeligheden af en bred vifte af transgene stammer i mus tillader etablering af musens PMU-modelsystem nu mere detaljerede mekanistiske undersøgelser for at identificere specifikke celletyper, veje og gener, der bidrager til patologien af denne sygdom.
Dyremodeller af uveitis kan demonstrere dyr til dyr variabilitet i forekomsten og intensiteten af inflammation41. I C57BL/6-musestammen genereres PMU pålideligt ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her. Stammespecifikke variationer i uveitisforløb og intensitet er rapporteret for både EAU og EIU42,43. Mens stammespecifikke virkninger på sværhedsgraden og forløbet af PMU ikke er blevet målt eksperimentelt, er denne model blevet brugt i vildtype C57BL / 6J såvel som i albinomus (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) og produceret lignende inflammatoriske reaktioner. Ved generering af PMU-modellen kan styring af nedenstående overvejelser hjælpe nye forskere med at begrænse variabilitet og producere den mest konsistente og reproducerbare uveitis.
Sørg for konsistens i de subkutane injektioner:
For at give en konsekvent subkutan injektion skal du sikre dig, at alle luftbobler fjernes fra emulsionen. Overvejelserne omfatter en kort centrifuge (30 s ved 400 x g) af den færdiglavede emulsion inden injektion af sprøjten. Dette fjerner luft fanget i emulsionen. Når sprøjten lægges i, skal du også regelmæssigt vende (tippe op) og trykke på sprøjten for at fjerne eventuelle luftbobler. Under injektionen må sprøjten ikke placeres for dybt for at undgå intramuskulær injektion. Omvendt kan en overfladisk (intradermal) injektion resultere i erosion af emulsionen gennem huden. Husk at holde en kort pause, før sprøjten fjernes fra injektionsstedet, for at sikre fuldstændig injektion af den tykke tyktflydende emulsion og for at forhindre tilbagesvaling fra huden.
Syv dage efter placering af den subkutane injektion skal du bekræfte tilstedeværelsen af håndgribelige knuder på hver side af bagbenene. Hvis der ikke kan identificeres knuder, er det muligt, at luft blev injiceret snarere end emulsion. I dette tilfælde er akut betændelse muligvis ikke så robust, og kronisk betændelse kan ikke udvikle sig.
Forhindre udvikling af infektiøs endophthalmitis:
Bakteriel eller svampe endophthalmitis vil generere en forvirrende variabel, hvis ikke forhindret44. For at forhindre bakteriel endophthalmitis skal du altid øve god aseptisk teknik, når du fremstiller den intravitreale suspension, håndtering og rengøring af alle genanvendelige værktøjer, der kommer i kontakt med øjet. Brug af sterile engangsartikler, autoklavering eller rengøring med 95% alkoholvask eller klude er vigtig. Passende brug af betadin påført den okulære overflade, låg og periokulær pels vil også hjælpe med at forhindre endophthalmitis45. Det er ligetil at genkende et øje med infektion, da de okulære strukturer vil blive udslettet af ekstrem betændelse under postinjektionsforløbet. Dette er ikke typisk for PMU. Tilstedeværelsen af intraokulær blødning kan også tyde endophthalmitis eller traumer fra injektionen. I sådanne tilfælde udelukkes disse dyr fra undersøgelsen.
Sørg for konsistens i den intravitreale injektion:
Den intravitreale injektion er et kritisk trin i induktionen af pålidelig og reproducerbar inflammation i PMU. Tilvejebringelse af en ensartet mængde Mtb-suspension med hver injektion, undgåelse af traumer og forebyggelse af tilbagesvaling af suspensionen er alle faktorer, der bør overvejes, når injektionerne udføres. For at sikre en ensartet suspension skal du skrue lagerophænget grundigt ved optøning og inden ilægning af det i sprøjten. Da dette anvendte Mtb-ekstrakt ikke danner en opløsning, kan suspensionen gennemgå sedimentering over tid. For at sikre ensartet koncentration af Mtb-ekstraktet i hver injektion skal du bruge eller udvise og genindlæse sprøjten inden for 15 minutter efter pålæsning. Phenylephrin bruges til udvidelse for at give et større synsfelt til det bageste øje og reducere risikoen for traumer i øjet under injektionen. Denne dråbe genererer naturlig lågretraktion og let proptose af kloden, hvilket muliggør god visualisering af området 1-2 mm bagud til limbus uden behov for at gribe øjet med tang. Brug af tang til at fastholde øjet kan forårsage potentielt traume og forbigående øge intraokulært tryk og risikoen for tilbagesvaling af Mtb-suspensionen. Traumer kan også være forårsaget af forsøg på at injicere for meget volumen i øjet. Injektionsvolumenet er begrænset til 2 μL for at forhindre betydelig og langvarig forhøjelse af intraokulært tryk og traumer i øjet. Derudover vil yngre dyr have øjne, der er mindre end voksne mus. Typisk 6-8 ugers mus (20-25 g) giver en ensartet øjenstørrelse og sikrer større konsistens i betændelsen efter injektion af Mtb. En højere hyppighed af tilbagesvaling efter injektion af den mykobakterielle suspension blev observeret hos mindre mus. Dette fører igen til en mindre end forventet akut betændelse. En fortyndet fluoresceinopløsning bruges til at give nybegynderinjektoren visuel feedback om succesen med deres injektionsteknik. Udvidelse på injektionstidspunktet giver mulighed for direkte visualisering af det injicerede materiale i glaslegemet og muligheden for at bemærke tegn på linsetraume. I tilfælde af linsetraume kan det forårsage en ændring i linseklarhed, der vil forårsage en grå stær, som kan visualiseres på OCT. I tilfælde af okulært traume skal øjnene udelukkes fra undersøgelsen på grund af muligheden for linseinduceret uveitis46. Vi anbefaler at holde pause i 10 sek., før sprøjten fjernes fra øjet for at tillade spredning af Mtb-suspensionen i øjet og mindske tilbagesvaling.
PMU-modellen kan modificeres for at ændre intensiteten af akut inflammation ved at variere koncentrationen af Mtb i den intravitreale injektion. Forskellige doser fra 2,5 μg/μL til 15 μg/μL er tidligere blevet testet i vores laboratorium. Imidlertid viste doser højere end 10 μg / μL at forårsage alvorlig øjenskade, herunder spontan linsebrud, alvorligt hornhindeødem og ardannelse og hyphema. Denne grad af sværhedsgrad er ikke typisk hos humane patienter med postinfektiøs uveitis, og derfor anbefales disse koncentrationer ikke. En dosis på 5 μg/μL viste sig pålideligt at producere mild til moderat akut inflammation og mild kronisk uveitis; 10 μg/μL dosis giver en pålidelig moderat til svær akut sygdom og mere bemærkelsesværdig kronisk sygdom. Således kan varierende intravitreal koncentration give alternative sygdoms sværhedsgrader til brug efter behov baseret på det eksperimentelle spørgsmål. Der bør vælges kontroller for at sikre, at resultaterne skyldes responsen på mTB og ikke traumer forbundet med de subkutane eller intravitreale injektioner. I sham injektionskontrol kan PBS anvendes i stedet for mTB-ekstraktet. For sammenligninger med ueksponerede dyr bør ægte naive prøver betragtes som medøjne ikke altid ens.
På grund af museøjets lille størrelse kan OCT være et mere følsomt assay til at detektere betændelse i det forreste kammer end direkte visualisering eller mikroskopisk lysfeltfotografering. Tidligere arbejde med PMU hos rotter25 fastslog, at flere celler kan påvises ved histologi end ved OCT, men at der er en god sammenhæng mellem de to modaliteter. OCT har den ekstra fordel, at det kan bruges til at overvåge betændelsen i længderetningen hos det samme dyr. Andre store musemodeller af uveitis, såsom EAU og EIU, har også anvendt OCT til kvantitativ analyse 12,47,48. I PMU-modellen af mus er forreste kammerceller kun synlige på OCT og kan ikke ses ved kliniske undersøgelser, medmindre en stor hypopyon er til stede. Glasagtig betændelse (vitritis) kan observeres med farve fundus billeddannelse, men detektering af kvantitativ ændring er kun mulig med OCT-billeddannelse. Andre aspekter af modellen, såsom retinal vaskulær inflammation og retinal skade, kan let identificeres med enten OCT og mikroskopisk brightfield fundus fotografering.
Når du bruger OCT, er det vigtigt at overveje, hvordan lokaliseret billeddannelse kan påvirkes af regionale forskelle i graden af inflammation. Tidligere rapporter har identificeret en ujævn fordeling af celler i det forreste kammer hos mennesker, med flere celler placeret ringere49. Hos mus er en lignende disposition almindelig. Således vil lodrette eller radiale scanninger gennem AC hjælpe med at sikre billeder, der fanger inflammationsområdet. Derudover vil udførelse af billeddannelse på samme sted også give konsistens til billeder indsamlet i samme øje i længderetningen. For at få billeder i samme del af øjet skal du bruge stabile landemærker og en systematisk tilgang. For forreste kammerbilleder er billedet centreret umiddelbart ved siden af hornhindens spids og orienteret lodret, så tilstedeværelsen af en hypopyon kan detekteres i den ringere vinkel. For bageste segmentbilleder er billedet centreret om synsnerven. Det anbefales at overveje at bruge mindst 3 linjescanninger til scoring for at sikre, at regional variabilitet registreres. I tilfælde, hvor betændelse er begrænset til perifere steder, kan det være nyttigt at erhverve volumenscanninger. Indsamlingen af volumenscanninger kan også hjælpe med at fange regionale variationer, men vil øge kravene til datalagring.
Andre in vivo-assays, der kan bruges til at karakterisere inflammation i PMU-musemodellen, inkluderer bioluminescensbilleddannelse13,35. Post mortem-assays som multi-parameter flow cytometrisk analyse kan udføres for at identificere og kvantificere infiltrerende immuncelletypepopulationer i øjets vandige og bageste kammer12,26. I PMU-modellen er akut inflammation karakteriseret ved et medfødt respons med et overvejende neutrofilinfiltrat efterfulgt af et kronisk og vedvarende adaptivt T-celle dominerende respons, der vedvarer i over en måned35. Andre assays af immunfunktion, der kan udføres på post mortem væv omfatter okulær væske cytokin analyse. Derudover kan andre downstream-assays som mRNA-sekventering og immunfluorescensbilleddannelse bruges til at vurdere gen- og proteinekspressionsmønstre for retinale immuncellepopulationer i uveitis50,51.
PMU-modellen kan replikeres i andre gnaversystemer ved hjælp af tilpasninger, der passer til de forskellige arter. PMU-modellen har tidligere været anvendt til rotter og kaniner38,39,40. Hos rotter udvikler akut panuveitis efter intravitreal injektion, der løser spontant over 14 dage uden at udvikle tegn på kronisk inflammation ved histologi24. Hos kaniner anvender induktion af uveitis to runder subkutan injektion før intravitreal injektion, men genererer også en robust panuveitis. En af fordelene ved at bruge musemodellen er den klare tilgængelighed af adskillige transgene og knockout-stammer, der kan hjælpe med at forstå den grundlæggende mekanisme for uveitis52. Alle gnavermodeller kan bruges til præklinisk terapitest, hvis midlet administreres systemisk eller som en aktuel dråbe. På grund af deres større størrelse er rotte- og kaninøjne imidlertid bedre modeller til brug i prækliniske undersøgelser af implanterbare eller lokale injektionsbehandlingsmuligheder for uveitis.
Sammenfattende giver denne protokol forskere, der er interesserede i at studere mekanismerne for kronisk okulær inflammation med et nyt værktøj, der ikke er afhængig af forudgående immunisering med okulære antigener.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes af finansiering fra National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), gaver fra Mark Daily, MD Research Fund og Christopher og Alida Latham Research Fund, en ubegrænset afdelingsbevilling fra Research to Prevent Blindness og karriereudviklingspris fra Research to Prevent Blindness (KP). Arbejdet i Bristol blev støttet af yderligere finansiering fra Sight Research UK og The Underwood Trust.
AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | — | |
GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | — | |
H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
Isoflurane | |||
Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
PBS | Gibco | 14190 | |
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |