Detta protokoll beskriver stegen för att inducera Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) hos möss. Denna metod beskriver stegen för att producera tillförlitlig och robust okulär inflammation i musmodellsystemet. Med hjälp av detta protokoll genererade vi uveitiska ögon och oinflammerade medögon från enstaka djur för vidare utvärdering med immunologiska, transkriptomiska och proteomiska analyser.
Termen “uveit” beskriver en heterogen uppsättning tillstånd som alla har intraokulär inflammation. I stort sett definieras uveit av etiologi: infektion eller autoimmunitet. Infektiös uveit kräver behandling med lämpliga antimikrobiella medel, medan autoimmun uveit kräver behandling med kortikosteroider eller andra immunsuppressiva medel. Postinfektiös uveit är en form av kronisk uveit som kräver kortikosteroider för att kontrollera immunföljder efter den första infektionen. Uveit associerad med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) -infektion är en välkänd form av postinfektiös uveit, men sjukdomsmekanismerna är inte helt förstådda. För att förstå vilken roll mykobakteriella antigener och medfödda ligander spelar för att stimulera kronisk okulär inflammation efter mTB-infektion, utvecklades modellen Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) för användning hos möss. Detta manuskript beskriver metoderna för att generera PMU och övervaka det kliniska förloppet av inflammation med hjälp av färgfundus och optisk koherenstomografi (OCT) avbildning. PMU induceras av immunisering med värmedödat mykobakteriellt extrakt följt av intravitreal injektion av samma extrakt i ett öga sju dagar senare. Okulär inflammation övervakas longitudinellt med hjälp av in vivo-avbildning och följs av provsamling för ett brett spektrum av analyser, inklusive histologi, flödescytometri, cytokinanalys, qPCR eller mRNA-sekvensering. Musmodellen av PMU är ett användbart nytt verktyg för att studera de okulära svaren på mTB, mekanismen för kronisk uveit, och för prekliniska effektivitetstester av nya antiinflammatoriska terapier.
Termen “uveit” beskriver en heterogen uppsättning tillstånd som alla har intraokulär inflammation1. Djurmodeller av uveit är viktiga för att förstå sjukdomsmekanismer och för preklinisk testning av nya terapier. Ett antal djurmodeller av uveit har etablerats2. De två som har studerats mest omfattande är experimentell autoimmun uveit (eller uveoretinit; EAU) och endotoxininducerad uveit (EIU). EAU genereras vanligtvis genom immunisering med okulära antigener eller kan uppstå spontant när central tolerans störs i frånvaro av AIRE-genen 3,4. Andra varianter av modellen har sedan dess utvecklats 5,6,7 för att inkludera olika uveitogena peptider; dessa har granskats omfattande 8,9,10. EAU är den primära modellen för former av T-cellberoende autoimmun uveit såsom Vogt-Koyanagi-Haradas sjukdom och fågelhot korioretinit hos människor. EIU genereras genom systemisk eller lokal injektion av bakteriell lipopolysackarid (LPS)10,11. EIU har använts som en modell av akut uveit som genereras genom aktivering av medfödda immunsignalvägar12. Båda modellerna har varit avgörande för den nuvarande förståelsen av okulär immunologi, men inte heller effektiva modeller för postinfektiös kronisk uveit. Nyligen etablerad hos möss ger Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) -modellen nu ett tillvägagångssätt för att förhöra och utvärdera kliniska och cellulära aspekter av denna form av uveit13.
Det finns en hög förekomst av mykobakteriell infektion över hela världen, med över 10 miljoner nya fall och mer än 1.4 miljoner dödsfall rapporterade av Världshälsoorganisationen 201914. Extrapulmonell manifestation av aktiv tuberkulosinfektion (TB) inkluderar uveit och är en välkänd orsak till infektiös uveit15,16. Manifestationerna av TB-associerad uveit är protean, vilket sannolikt återspeglar flera distinkta sjukdomsmekanismer för att inkludera direkt okulär infektion samt mindre väl förstådd immunmedierad inflammation17,18,19. De föreslagna mekanismerna för dessa postinfektiösa följdsjukdomar inkluderar ett kroniskt inflammatoriskt svar stimulerat av persistensen av en pauci-bacillärinfektion i retinalpigmentepitelet (RPE), ett kroniskt inflammatoriskt svar stimulerat av närvaron av kvarvarande patogenassocierade molekylära mönster (PAMP) från en framgångsrikt rensad okulär infektion och olämplig aktivering av det adaptiva immunsvaret mot okulära antigener genom en process av molekylär mimik eller antigen spridning orsakad av systemisk TB-infektion20,21,22,23.
För att få en bättre mekanistisk förståelse av kronisk postinfektiös uveit och studera rollen av mykobakteriella antigener vid initiering av sjukdom utvecklades PMU-modellen för användning hos möss13,24. För att framkalla inflammation får musen därför först en subkutan injektion av antigen från den värmedödade Mycobacterium tuberculosis H37Ra-stammen för att efterlikna systemisk infektion, följt sju dagar senare av intravitreal injektion av samma antigen administrerat till vänster eller höger öga för att efterlikna lokal okulär infektion. Intensiteten och varaktigheten av den efterföljande uveiten övervakas genom longitudinell in vivo optisk koherenstomografi (OCT) och fundal avbildning av ögat25. PMU kännetecknas av en akut, myeloid-dominerande panuveit som utvecklas till en kronisk T-celldominerande bakre uveit med vitrit, perivaskulär retinal inflammation och fokalområden med yttre retinal skada26. Förekomsten av granulomatös inflammation i det bakre segmentet av ögat tyder på att PMU-modellen kan användas för att studera vissa former av främre (granulomatös och icke-granulomatös) och mellanliggande uveit, sett hos patienter med immunologiska bevis på tidigare Mtb-infektion27. Dessutom har komponenterna i värmedödad Mtb som används i PMU-modellen föreslagits för att utlösa immunsvar som ligger till grund för aspekterna av återkommande uveit hos patienter med okulär tuberkulos som svarar på anti-tuberkulär terapi (ATT)28. På grund av skillnaderna i sjukdomsinitiering och inflammatoriskt förlopp jämfört med EAU och EIU representerar PMU en ny djurmodell av uveit som inte är beroende av immunisering med okulära antigener och kan hjälpa till att belysa sjukdomsmekanismer hos patienter med kronisk uveit. Detta protokoll beskriver metoderna för att generera PMU, övervaka det kliniska förloppet av inflammation och samla in okulära prover för post-mortemanalys med flödescytometri.
Djurmodeller av uveit har varit avgörande för att förstå mekanismerna för okulär inflammation och homeostas samt möjliggjort preklinisk utvärdering av medicinska och kirurgiska terapier för patienter med uveit37. Både kanin- och råttvarianter av PMU-modellen har visat sitt värde i preklinisk terapi via proof of concept-studier38,39,40. På grund av tillgången på ett varierat utbud av transgena stammar hos möss tillåter etablering av musens PMU-modellsystem nu mer detaljerade mekanistiska studier för att identifiera specifika celltyper, vägar och gener som bidrar till patologin för denna sjukdom.
Djurmodeller av uveit kan visa djur till djur variabilitet i förekomst och intensitet av inflammation41. I C57BL/6-musstammen genereras PMU tillförlitligt med hjälp av protokollet som beskrivs här. Stamspecifika variationer i uveitförlopp och intensitet har rapporterats för både EAU och EIU42,43. Medan stamspecifika effekter på svårighetsgrad och förlopp av PMU inte har mätts experimentellt, har denna modell använts i vildtyp C57BL / 6J såväl som hos albinomöss (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) och producerat liknande inflammatoriska svar. Genom att generera PMU-modellen kan kontroll av övervägandena nedan hjälpa nya forskare att begränsa variationen och producera den mest konsekventa och reproducerbara uveiten.
Se till att de subkutana injektionerna är konsekventa:
För att ge en konsekvent subkutan injektion, se till att alla luftbubblor avlägsnas från emulsionen. Överväganden inkluderar en kort centrifug (30 s vid 400 x g) av den färdiga emulsionen innan sprutan laddas. Detta kommer att ta bort luft som fångas i emulsionen. När du laddar sprutan, invertera (tip-up) regelbundet och knacka på sprutan för att ta bort eventuella luftbubblor. Placera inte sprutan för djupt under injektionen för att undvika intramuskulär injektion. Omvänt kan en grund (intradermal) injektion resultera i erosion av emulsionen genom huden. Kom ihåg att pausa en kort stund innan du tar bort sprutan från injektionsstället för att säkerställa fullständig injektion av den tjocka viskösa emulsionen och för att förhindra återflöde från huden.
Sju dagar efter att ha placerat den subkutana injektionen, bekräfta närvaron av palpabla knölar på vardera sidan av bakbenen. Om inga knölar kan identifieras är det möjligt att luft injicerades snarare än emulsion. I detta fall kan akut inflammation inte vara lika robust, och kronisk inflammation kanske inte utvecklas.
Förhindra utvecklingen av infektiös endoftalmit:
Bakteriell eller svamp endoftalmitis kommer att generera en förvirrande variabel om den inte förhindras44. För att förhindra bakteriell endoftalmit, öva alltid god aseptisk teknik när du gör den intravitreala suspensionen, hanterar och rengör alla återanvändbara verktyg som kommer i kontakt med ögat. Att använda sterila engångsartiklar, autoklavering eller rengöring med 95% alkoholtvättar eller våtservetter är viktigt. Lämplig användning av betadin applicerad på ögonytan, locken och periokulär päls hjälper också till att förhindra endoftalmit45. Det är enkelt att känna igen ett öga med infektion eftersom de okulära strukturerna kommer att utplånas av extrem inflammation under kursen efter injektionen. Detta är inte typiskt för PMU. Förekomsten av intraokulär blödning kan också föreslå endoftalmit eller trauma från injektionen. I sådana fall utesluter du dessa djur från studien.
Se till att den intravitreala injektionen är konsekvent:
Den intravitreala injektionen är ett kritiskt steg i induktionen av tillförlitlig och reproducerbar inflammation i PMU. Att tillhandahålla en konsekvent mängd Mtb-suspension vid varje injektion, undvika trauma och förhindra återflöde av suspensionen är alla faktorer som bör beaktas vid utförandet av injektionerna. För att säkerställa en konsekvent suspension, virvla stamsuspensionen noggrant vid upptining och innan du laddar den i sprutan. Eftersom detta Mtb-extrakt som används inte bildar en lösning kan suspensionen genomgå sedimentering över tiden. För att säkerställa en jämn koncentration av Mtb-extraktet i varje injektion, använd eller släpp ut och ladda om sprutan inom 15 minuter efter lastning. Fenylefrin används för utvidgning för att ge ett större synfält till det bakre ögat och minska risken för trauma i ögat under injektionen. Denna droppe genererar naturlig lockindragning och lätt proptos av världen, vilket möjliggör god visualisering av området 1-2 mm bakom limbus utan att behöva ta tag i ögat med pincett. Att använda tång för att hålla fast ögat kan orsaka potentiellt trauma och tillfälligt öka det intraokulära trycket och risken för återflöde av Mtb-suspensionen. Trauma kan också orsakas av att försöka injicera för mycket volym i ögat. Injektionsvolymen är begränsad till 2 μL för att förhindra signifikant och långvarig höjning av intraokulärt tryck och trauma i ögat. Dessutom kommer yngre djur att ha ögon som är mindre än vuxna möss. Vanligtvis ger 6-8 veckors möss (20-25 g) en enhetlig ögonstorlek och säkerställer större konsistens i inflammationen efter injektion av Mtb. En högre frekvens av återflöde efter injektion av den mykobakteriella suspensionen observerades hos mindre möss. Detta leder i sin tur till en mindre än förväntad akut inflammation. En utspädd fluoresceinlösning används för att ge nybörjarens injektor visuell återkoppling om framgången med deras injektionsteknik. Dilatation vid injektionstillfället möjliggör direkt visualisering av det injicerade materialet i glaskroppen och möjligheten att notera eventuella tecken på linstrauma. Vid linstrauma kan det orsaka en förändring i linsklarheten som orsakar grå starr som kan visualiseras på OCT. Vid okulärt trauma måste ögonen uteslutas från studien på grund av möjligheten till linsinducerad uveit46. Vi rekommenderar att du pausar i 10 s innan du tar bort sprutan från ögat för att möjliggöra spridning av Mtb-suspensionen i ögat och minska återflödet.
PMU-modellen kan modifieras för att ändra intensiteten av akut inflammation genom att variera koncentrationen av Mtb i den intravitreala injektionen. Olika doser från 2,5 μg/μL till 15 μg/μL har testats tidigare i vårt labb. Doser högre än 10 μg/μL visade sig dock orsaka allvarliga ögonskador, inklusive spontan linsbrott, svårt hornhinneödem och ärrbildning samt hyfem. Denna svårighetsgrad är inte typisk hos humana patienter med postinfektiös uveit, och därför rekommenderas inte dessa koncentrationer. En dos på 5 μg/μL visade sig på ett tillförlitligt sätt ge mild till måttlig akut inflammation och mild kronisk uveit; dosen 10 μg/μl ger en tillförlitligt måttlig till svår akut sjukdom och mer anmärkningsvärd kronisk sjukdom. Således kan varierande intravitreal koncentration ge alternativa sjukdoms svårighetsgrader för användning efter behov baserat på den experimentella frågan. Kontroller bör väljas för att säkerställa att resultaten beror på svaret på mTB och inte trauma i samband med subkutana eller intravitreala injektioner. I skeninjektionskontrollerna kan PBS användas i stället för mTB-extraktet. För jämförelser med oexponerade djur bör sanna naiva prover betraktas som andra ögon är inte alltid likvärdiga.
På grund av musögats lilla storlek kan OCT vara en känsligare analys för att upptäcka inflammation i den främre kammaren än direkt visualisering eller mikroskopisk ljusfältfotografering. Tidigare arbete med PMU hos råttor25 bestämde att fler celler kan detekteras med histologi än med OCT men att det finns en god korrelation mellan de två modaliteterna. OCT har den extra fördelen att det kan användas för att övervaka inflammationen i längdriktningen hos samma djur. Andra stora musmodeller av uveit, såsom EAU och EIU, har också använt OCT för kvantitativ analys 12,47,48. I PMU-modellen av möss är främre kammarceller endast synliga på OCT och kan inte ses på kliniska undersökningar om inte en stor hypopyon är närvarande. Glasartad inflammation (vitrit) kan observeras med färgfondusavbildning, men att upptäcka kvantitativ förändring är endast möjlig med OCT-avbildning. Andra aspekter av modellen, såsom retinal vaskulär inflammation och retinal skada, kan lätt identifieras med antingen OCT och mikroskopisk brightfield fundus-fotografering.
När du använder OCT är det viktigt att överväga hur lokaliserad avbildning kan påverkas av regionala skillnader i graden av inflammation. Tidigare rapporter har identifierat en ojämn fördelning av celler i människans främre kammare, med fler celler som ligger sämreän 49. Hos möss är en liknande predisposition vanlig. Således kommer vertikala eller radiella skanningar genom AC att bidra till att säkerställa bilder som fångar inflammationsområdet. Dessutom kommer avbildning på samma plats också att ge konsekvens till bilder som samlas in i samma öga i längdriktningen. För att få bilder i samma del av ögat, använd stabila landmärken och ett systematiskt tillvägagångssätt. För främre kammarbilder är bilden centrerad omedelbart intill hornhinnans topp och orienterad vertikalt så att närvaron av en hypopyon kan detekteras i underlägsen vinkel. För bakre segmentbilder är bilden centrerad på synnerven. Vi rekommenderar att du överväger att använda minst 3 raders genomsökningar för bedömning för att säkerställa att regional variabilitet fångas upp. I fall där inflammation är begränsad till perifera platser kan det vara till hjälp att skaffa volymskanningar. Insamlingen av volymgenomsökningar kan också hjälpa till att fånga regionala variationer men kommer att öka datalagringskraven.
Andra in vivo-analyser som kan användas för att karakterisera inflammation i PMU-musmodellen inkluderar bioluminescensavbildning13,35. Post-mortem-analyser som cytometrisk analys av flera parameterflöden kan utföras för att identifiera och kvantifiera infiltrerande immuncellstyppopulationer i den vattenhaltiga och bakre kammaren i ögat12,26. I PMU-modellen kännetecknas akut inflammation av ett medfött svar med ett dominerande neutrofilt infiltrat, följt av ett kroniskt och ihållande adaptivt T-celldominerande svar som kvarstår i över en månad35. Andra analyser av immunfunktionen som kan utföras på post-mortemvävnader inkluderar okulärvätska cytokinanalys. Dessutom kan andra nedströmsanalyser som mRNA-sekvensering och immunofluorescensavbildning användas för att bedöma gen- och proteinuttrycksmönster för retinala immuncellpopulationer vid uveit50,51.
PMU-modellen kan replikeras i andra gnagarsystem med hjälp av anpassningar som är lämpliga för de olika arterna. PMU-modellen har tidigare använts på råttor och kaniner38,39,40. Hos råttor utvecklas akut panuveit efter intravitreal injektion som försvinner spontant under 14 dagar utan att utveckla tecken på kronisk inflammation genom histologi24. Hos kaniner utnyttjar induktion av uveit två omgångar subkutan injektion före intravitreal injektion men genererar också en robust panuveit. En av fördelarna med att använda musmodellen är den färdiga tillgängligheten av många transgena och knockout-stammar som kan hjälpa till att förstå den grundläggande mekanismen för uveit52. Alla gnagarmodeller kan användas för preklinisk terapitestning om medlet administreras systemiskt eller som en topisk droppe. På grund av sin större storlek är dock rått- och kaninögon bättre modeller för användning i prekliniska studier av implanterbara eller lokala injektionsbehandlingsalternativ för uveit.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll forskare som är intresserade av att studera mekanismerna för kronisk okulär inflammation med ett nytt verktyg som inte är beroende av tidigare immunisering med okulära antigener.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av finansiering från National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), gåvor från Mark Daily, MD Research Fund och Christopher and Alida Latham Research fund, ett obegränsat avdelningsbidrag från Research to Prevent Blindness och karriärutvecklingspris från Research to Prevent Blindness (KP). Arbetet som utfördes i Bristol stöddes av ytterligare finansiering från Sight Research UK och The Underwood Trust.
AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | — | |
GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | — | |
H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
Isoflurane | |||
Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
PBS | Gibco | 14190 | |
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |