Ricostituzione dell'attività estrattiva msp1 con componenti completamente purificati

Summary

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostituzione dell’attività di estrazione di Msp1 con componenti completamente purificati in proteolipolisi definiti.

Abstract

Come centro per la fosforilazione ossidativa e la regolazione apoptotica, i mitocondri svolgono un ruolo vitale nella salute umana. La corretta funzione mitocondriale dipende da un robusto sistema di controllo della qualità per mantenere l’omeostasi proteica (proteostasi). Il declino della proteostasi mitocondriale è stato collegato al cancro, all’invecchiamento, alla neurodegenerazione e a molte altre malattie. Msp1 è un’ATPasi AAA+ ancorata nella membrana mitocondriale esterna che mantiene la proteostasi rimuovendo le proteine non localizzate ancorate alla coda. Utilizzando componenti purificati ricostituiti in proteoliposomi, abbiamo dimostrato che Msp1 è necessario e sufficiente per estrarre una proteina modello ancorata alla coda da un doppio strato lipidico. Il nostro sistema ricostituito semplificato supera molte delle barriere tecniche che hanno ostacolato lo studio dettagliato dell’estrazione delle proteine di membrana. Qui, forniamo metodi dettagliati per la generazione di liposomi, la ricostituzione delle proteine di membrana e il test di estrazione Msp1.

Introduction

La corretta funzione cellulare dipende da un processo chiamato proteostasi, che assicura che le proteine funzionali siano alla corretta concentrazione e posizione cellulare¹. I fallimenti nella proteostasi portano a compromissione della funzione degli organelli e sono associati a molte malattie neurodegenerative^2,3,4. Le proteine di membrana presentano sfide uniche per la rete di proteostasi in quanto devono essere mirate alla membrana corretta evitando l’aggregazione dai domini transmembrana idrofobici (TMD)⁵. Di conseguenza, macchinari specializzati si sono evoluti per proteggere la TMD idrofobica dal citosol e facilitare il targeting e l’inserimento nella corretta membrana cellulare^{6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15.}

I mitocondri sono il fulcro metabolico della cellula e sono coinvolti in numerosi processi cellulari essenziali quali: fosforilazione ossidativa, generazione di cluster ferro-zolfo e regolazione apoptotica^16,17. Questi organelli endosimbiotici contengono due membrane, denominate membrana mitocondriale interna (IMM) e membrana mitocondriale esterna (OMM). Oltre il 99% delle 1.500 proteine mitocondriali umane sono codificate nel genoma nucleare e devono essere traslocate attraverso una o due diverse membrane^18,19. La corretta funzione mitocondriale dipende quindi da una robusta rete di proteostasi per correggere eventuali errori nel targeting o nella traslocazione delle proteine.

Il nostro laboratorio si concentra su un sottoinsieme di proteine di membrana mitocondriale chiamate proteine ancorate alla coda (TA), che hanno un singolo dominio transmembrana al C-terminus^{20,21,22,23,24.} Le proteine TA sono coinvolte in una serie di processi essenziali, come l’apoptosi, il trasporto delle vescicole e la traslocazione delle proteine²⁵. La topologia unica delle proteine TA richiede l’inserimento post-traduzionale, che avviene nel reticolo endoplasmatico (ER) da parte del Guided Entry of Tail-anchored (GET) o delle vie EMC (EMC) del reticolo endoplasmatico o nell’OMM da una via scarsamente caratterizzata^20,26,27,28. Le proprietà biofisiche della TMD sono necessarie e sufficienti per guidare le proteine TA alla corretta membrana^29. Il riconoscimento delle caratteristiche biofisiche piuttosto che di un motivo di sequenza definito limita la fedeltà delle vie di targeting⁵. Pertanto, l’errata localizzazione delle proteine TA è uno stress comune per le reti di proteostasi. Lo stress cellulare, come l’inibizione della via GET, provoca un aumento della mislocalizzazione proteica all’OMM e disfunzione mitocondriale a meno che queste proteine non vengano prontamente rimosse^30,31.

Un tema comune nella proteostasi di membrana è l’uso di proteine AAA+(ATPasi Associate con attività cellulari A)per rimuovere proteine vecchie, danneggiate o mal localizzate dal doppio strato lipidico^{1,32,33,34,35,36,37,38} . Le proteine AAA+ sono motori molecolari che formano anelli esamerici e subiscono movimenti dipendenti dall’ATP per rimodellare un substrato, spesso per traslocazione attraverso uno stretto poro assiale^39,40. Sebbene grande sforzo sia stato dedicato allo studio dell’estrazione di proteine di membrana da parte delle ATPasi AAA+, le ricostituzioni sono complesse o coinvolgono una miscela di lipidi e detergente^41,42,che limita il potere sperimentale di esaminare il meccanismo di estrazione del substrato dal doppio strato lipidico.

Msp1 è un’ATPasi AAA+ altamente conservata ancorata nell’OMM e nei perossisomi che svolge un ruolo critico nella proteostasi di membrana rimuovendo le proteine TA^{43, 44,45,46,47,}erroneamente non localizzate. Msp1 ha anche recentemente dimostrato di alleviare lo stress da importazione di proteine mitocondriali rimuovendo le proteine di membrana che si bloccano durante la traslocazione attraverso l’OMM^48. La perdita di Msp1 o dell’omologo umano ATAD1 provoca frammentazione mitocondriale, fallimenti nella fosforilazione ossidativa, convulsioni, aumento delle lesioni a seguito di ictus e morte precoce^{31,49,50,51,52,53,54,55,56.}

Abbiamo dimostrato che è possibile co-ricostituire le proteine TA con Msp1 e rilevare l’estrazione dal doppio strato lipidico⁵⁷. Questo sistema semplificato utilizza proteine completamente purificate ricostituite in liposomi definiti che imitano l’OMM (Figura 1)^58,59. Questo livello di controllo sperimentale può affrontare dettagliate questioni meccanicistiche di estrazione del substrato che sono sperimentalmente intrattabili con ricostituzioni più complesse che coinvolgono altre proteine AAA +. Qui, forniamo protocolli sperimentali che descrivono in dettaglio i nostri metodi per la preparazione dei liposomi, la ricostituzione delle proteine di membrana e il test di estrazione. La nostra speranza è che questi dettagli sperimentali facilitino ulteriori studi sul processo essenziale ma poco compreso della proteostasi di membrana.

Protocol

1. Preparazione dei liposomi Combinare le scorte di cloroformio dei lipidi in rapporti appropriati per imitare la membrana mitocondriale esterna. Preparare 25 mg di miscela lipidica. Utilizziamo una miscela precedentemente stabilita di lipidi che imitano le membrane mitocondriali, costituita da un rapporto molare 48:28:10:10:4 di fosfatidilcolina (PC) uovo di gallina, fosfatidil etanolammina (PE) dell’uovo di gallina, fosfatidil-inositolo (PI) del fegato bovino, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina …

Representative Results

Per interpretare correttamente i risultati, il gel antimacchia e il western blot devono essere visti insieme. Il gel antimacchia garantisce un carico uguale su tutti i campioni. Quando si visualizza il gel antimacchia, gli accompagnatori (GST-calmodulina e GST-SGTA) saranno visibili nelle corsie INPUT (I) ed ELUTE (E). Ricontrollare che l’intensità di queste bande sia uniforme su tutti i campioni INPUT. Allo stesso modo, assicurarsi che l’intensità sia uniforme tra i campioni ELUTE. L’ELUTE è 5 volte più concentrato …

Discussion

La corretta funzione mitocondriale dipende da un robusto sistema di controllo della qualità delle proteine. A causa dei limiti intrinseci nella fedeltà delle vie di targeting delle proteine TA, le proteine TA mal localizzate sono una fonte costante di stress per i mitocondri. Un componente chiave della rete di proteostasi mitocondriale è Msp1, che è una membrana ancorata AAA + ATPasi che rimuove le proteine TA mal localizzate dall’OMM. Qui, abbiamo descritto come preparare i proteoliposomi, co-ricostituire Msp1 e una…

Materials

Biobeads	Bio-Rad	1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol	Avanti	840042C	PI
Chicken egg phosphatidyl choline	Avanti	840051C	PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine	Avanti	840021C	PE
ECL Select western blotting detection reagent	GE	RPN2235
Filter supports	Avanti	610014
Glass vial	VWR	60910L-1
Glutathione spin column	Thermo Fisher	PI16103
Goat anti-rabbit	Thermo Fisher	NC1050917
Mini-Extruder	Avanti	610020
Polycarbonate membrane	Avanti	610006	200 nM
PVDF membrane	Thermo Fisher	88518	45 µM
Rabbit anti-FLAG	Sigma-Aldrich	F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti	840035C	DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol	Avanti	710335C	TOCL
Syringe, 1 mL	Norm-Ject	53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight	Avanti	610017