انتقال المرحلة البصرية من TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية ليرقات حمار وحشي
Summary
نحن نصف بروتوكولا للحث على الانتقال المرحلي للبروتين الرابط للحمض النووي TAR 43 (TDP-43) عن طريق الضوء في الخلايا العصبية الحركية الشوكية باستخدام سمك الحمار الوحشي كنموذج.
Abstract
تجميع البروتين غير طبيعي وضعف الخلايا العصبية الانتقائية هما السمتان الرئيسيتان للأمراض العصبية التنكسية. ويمكن استجواب العلاقات السببية بين هذه الميزات من خلال التحكم في مرحلة انتقال البروتين المرتبط بالمرض في نوع الخلية الضعيفة، على الرغم من أن هذا النهج التجريبي كان محدودا حتى الآن. هنا، ونحن نصف بروتوكول للحث على مرحلة الانتقال من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي ملزمة البروتين TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية من يرقات حمار وحشي لنمذجة تجميع السيتوبلازمية من TDP-43 التي تحدث في الخلايا العصبية الحركية المنحطة في التصلب الجانبي الضموري (ALS). نحن نصف طريقة وراثية بكتيرية للكروموسوم الاصطناعي (BAC) لتقديم متغير TDP-43 البصري بشكل انتقائي إلى الخلايا العصبية الحركية الشوكية لسمك الحمار الوحشي. تسمح الشفافية العالية ليرقات حمار وحشي بالانتقال المرحلي ل TDP-43 البصري في الخلايا العصبية الحركية الشوكية عن طريق إضاءة خارجية بسيطة باستخدام ثنائي الباعث للضوء (LED) ضد الأسماك غير المقيدة. كما نقدم سير عمل أساسي للتصوير الحي للخلايا العصبية الحركية الشوكية حمار وحشي وتحليل الصور مع برامج فيجي / ImageJ المتاحة بحرية لتوصيف استجابات TDP-43 optogenetic للضوء. يمكن هذا البروتوكول من توصيف مرحلة انتقال TDP-43 والتكوين الكلي في بيئة خلوية ضعيفة من ALS ، مما يسهل التحقيق في عواقبه الخلوية والسلوكية.
Introduction
تتحكم حبيبات ريبونوكليوبروتين (RNP) في عدد لا يحصى من الأنشطة الخلوية في النواة والسيتوبلازم من خلال تجميع أقسام خالية من الأغشية عبر فصل المرحلة السائلة السائلة (LLPS) ، وهي ظاهرة يتحول فيها السائل المتجانس إلى مرحلتين سائلتين متميزتين1،2. وLPS dysregulated من البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة التي تعمل عادة كمكونات حبيبات RNP تعزيز مرحلة الانتقال غير طبيعي، مما يؤدي إلى تجميع البروتين. وقد تورطت هذه العملية في الأمراض العصبية النمائية والعصبية3,4,5. التقييم الدقيق للعلاقة السببية بين LLPS الشاذة من البروتينات الرابطة الحمض النووي الريبي ومسببات الأمراض أمر بالغ الأهمية لتحديد ما إذا كان وكيفية يمكن استغلال LLPS كهدف علاجي فعال. من السهل نسبيا دراسة البروتين الملزم الحمض النووي الريبي في المختبر وفي النماذج أحادية الخلية ولكنه صعب في الكائنات متعددة الخلايا ، خاصة في الفقاريات. شرط حاسم لتحليل مثل هذه LLPS في الخلايا الفردية داخل بيئة الأنسجة هو التعبير بشكل ثابت عن مسبار لتصوير والتلاعب LLPS في نوع من الخلايا المعرضة للمرض من الفائدة.
التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو اضطراب عصبي قاتل في نهاية المطاف حيث يتم فقدان الخلايا العصبية الحركية في الدماغ والحبل الشوكي بشكل انتقائي وتدريجي بسبب الانحطاط. حتى الآن، ارتبطت الطفرات في أكثر من 25 جينا بالشكل الوراثي (أو العائلي) من ALS، والذي يمثل 5٪ -10٪ من إجمالي حالات ALS، وبعض هذه الجينات المسببة ل ALS تقوم بترميز البروتينات الملزمة للجيش الملكي النيبالي التي تتكون من الحمض النووي الريبي، مثل hnRNPA1 و TDP-43 و FUS6,7. وعلاوة على ذلك، يتميز الشكل المتقطع من ALS، الذي يمثل 90٪ -95٪ من إجمالي حالات ALS، بتجميع السيتوبلازمي من TDP-43 المودعة في الخلايا العصبية الحركية المنحطة. ومن الخصائص الرئيسية لهذه البروتينات المرتبطة ب ALS الرابطة الحمض النووي الريبي هي مناطقها المضطربة في جوهرها (IDRs) أو المجالات منخفضة التعقيد التي تفتقر إلى هياكل ثلاثية الأبعاد أمر والتوسط في التفاعلات البروتين البروتين ضعيفة مع العديد من البروتينات المختلفة التي تدفع LLPS7،8. حقيقة أن الطفرات المسببة لل ALS غالبا ما تحدث في IDRs أدى إلى فكرة أن LLPS الشاذة والانتقال المرحلي لهذه البروتينات المرتبطة ب ALS قد تكمن وراء المرض المرض9،10.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طريقة optoDroplet ، وهي تقنية أوبتيوجينيتية تعتمد على Cryptochrome 2 تسمح بتعديل التفاعلات البروتينية البروتينية عن طريق الضوء ، للحث على الانتقال التدريجي للبروتينات مع IDRs11. وبما أن هذه التقنية قد تم تمديدها بنجاح إلى TDP-43 ، فقد بدأت في الكشف عن الآليات الكامنة وراء المرحلة الانتقالية المرضية من TDP-43 وما يرتبط بها من السمية الخلوية12،13،14،15. في هذا البروتوكول، نحدد طريقة وراثية لتقديم TDP-43 البصرية لأنواع الخلايا المعرضة للخطر ALS، وهي الخلايا العصبية الحركية الشوكية في حمار وحشي باستخدام BAC لجين mnr2b/mnx2b ترميز بروتين هودومين لمواصفات الخلايا العصبية الحركية16،17. تسمح الشفافية العالية ليرقات حمار وحشي بتحفيز الضوء البسيط وغير الباضع ل TDP-43 optogenetic الذي يؤدي إلى انتقال المرحلة في الخلايا العصبية الحركية الشوكية. كما نقدم سير عمل أساسي للتصوير الحي للخلايا العصبية الحركية الشوكية حمار وحشي وتحليل الصور باستخدام برنامج فيجي / ImageJ المتاح بحرية لتوصيف استجابات TDP-43 البصرية لتحفيز الضوء. تسمح هذه الطرق بإجراء تحقيق في مرحلة انتقال TDP-43 في بيئة خلوية ضعيفة من ALS وينبغي أن تساعد في استكشاف عواقبها المرضية على المستويات الخلوية والسلوكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعبير mnr2b-BAC بوساطة opTDP-43h وEGFP-TDP-43z في حمار وحشي يوفر فرصة فريدة للتصوير الحي للانتقال المرحلة TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية. الشفافية البصرية لأنسجة الجسم من يرقات حمار وحشي يسمح لتحفيز optogenetic بسيطة وغير الباضعة من opTDP-43h. أظهرت المقارنات بين الخلايا العصبية الحركية الشوكية ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق سيريكا (KA) وأرقام منحة KAKENHI JP19K06933 (KA) وJP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Biologie du développement. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).
