Décellularisation pour la préparation d’une matrice cutanée acellulaire humaine hautement préservée pour la médecine régénérative

Résumé

La peau humaine décellularisée convient à la régénération des tissus. Un problème majeur de la décellularisation est la préservation de l’architecture native, ainsi que le contenu approprié des protéines structurelles, des glycosaminoglycanes (GAG) et des facteurs de croissance. La méthode proposée permet une décellularisation rapide et efficace, produisant une peau décellularisée avec des caractéristiques natives bien préservées.

Résumé

La matrice extracellulaire (ECM) fournit des stimuli biophysiques et biochimiques pour soutenir l’auto-renouvellement, la prolifération, la survie et la différenciation des cellules environnantes en raison de sa teneur en diverses molécules bioactives. En raison de ces caractéristiques, l’ECM a récemment été considéré comme un candidat prometteur pour la création d’échafaudages biologiques visant à stimuler la régénération des tissus. Des études émergentes ont démontré que les tissus humains décellularisés pourraient ressembler à l’ECM native dans leurs profils structurels et biochimiques, préservant l’architecture tridimensionnelle (3D) et le contenu des molécules biologiques fondamentales. Par conséquent, la MEC décellularisée peut être utilisée pour favoriser le remodelage tissulaire, la réparation et la reconstruction fonctionnelle de nombreux organes. Le choix de la procédure de décellularisation appropriée est crucial pour obtenir des tissus acellulaires qui conservent les caractéristiques du microenvironnement idéal pour les cellules.

Le protocole décrit ici fournit une description détaillée, étape par étape, de la méthode de décellularisation pour obtenir une MEC biologique acellulaire reproductible et efficace. Des fragments de peau de patients subissant une chirurgie plastique ont été réduits et décellularisés à l’aide d’une combinaison de dodécylsulfate de sodium (SDS), de Triton X-100 et d’antibiotiques. Pour favoriser le transport régulier et homogène de la solution à travers les échantillons, ceux-ci ont été enfermés dans des cassettes d’enrobage afin d’assurer une protection contre les agressions mécaniques. Après la procédure de décellularisation, la couleur blanche comme neige des fragments de peau indiquait une décellularisation complète et réussie. De plus, les échantillons décellularisés ont montré une architecture intacte et bien conservée. Les résultats suggèrent que la méthode de décellularisation proposée était efficace, rapide et reproductible et protégeait les échantillons des dommages architecturaux.

Introduction

L’ECM sert d’échafaudage pour les cellules, les soutenant à travers une architecture complexe maintenue par différents composants, et c’est l’un des principaux facteurs responsables des propriétés mécaniques du cœur et de la fonction du tissu cardiaque ^1,2. De plus en plus de preuves suggèrent que l’ECM joue un rôle actif dans le remodelage des tissus, ce qui rend obsolète l’hypothèse conventionnelle selon laquelle l’ECM est un composant passif 3,4,5,6.

Protocole

Les échantillons de tissus humains ont été collectés conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et en respectant les directives de l’hôpital universitaire « Federico II ». Tous les patients participant à cette étude ont fourni des formulaires de consentement écrits.

1. Préparation des solutions

1. Préparation de 1200 mL de solution décellularisante à 1 %
   1. Préparez 600 mL de solution Triton X-100 à 2 % en mesurant 588 mL d’eau doublement distillée dans un cylindre gradué et en le transférant dans un bécher de 1 L. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 12 mL de Triton X-10....

Résultats

L’objectif du protocole était d’obtenir un échantillon de d-ECM cutané à partir de tissus biologiques, en maintenant une structure 3D bien organisée et un contenu bien préservé des molécules biologiques (Figure 1). Cette méthode est principalement basée sur l’agitation constante des échantillons dans une solution contenant la combinaison de deux détergents, Triton X-100 et SDS, préservant ainsi les caractéristiques biologiques et structurelles typiques du ti.......

Discussion

Bien que le protocole décrit ci-dessus ait été optimisé et amélioré par rapport aux protocoles précédemment publiés, il présente quelques étapes critiques qui nécessitent attention et précision. La formation de mousse doit être évitée lors de la préparation de la solution de décellularisation pour éviter une dilution incorrecte des détergents. Cela pourrait être résolu en versant doucement les solutions et en les faisant couler le long de la face intérieure du cylindre. De plus, des préc.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,9 % NaCl isotonique Solution physiologique	Sigma-Aldrich	S8776	0,9 % dans l’eau
1 L bécher	VWR	511-0318	Nettoyer et autoclaver avant utilisation
10 mL pipette sérologique	Falcon	357551	Stérile, polystyrène
100 mm	plaques Falcon	351029	Boîte de culture cellulaire stérile traitée
15 mL	Falcon	352097	Centrifugeuse Tubes stériles, polypropylène
1 L cylindre gradué	VWR	612-1524	Nettoyer et autoclaver avant utilisation
Flacon de 2 L	VWR	215-1596	Nettoyer et autoclaver avant utilisation
Pipette sérologique	Falcon	357525	Stérile, en polystyrène
2 L Cylindre gradué	VWR	612-3072	Propre et autoclave avant utilisation
Bécher de 500 mL	VWR	511-0317	Nettoyer et autoclaver avant utilisation
Amphotéricine B	Sigma-Aldrich	Y0000005
Planche de dissection de	VWR	100498-398	Fabriqué en polyéthylène haute densité.
Scalpel de dissection	VWR	233-5526	Cassettes d’encastrement stériles et jetables
	Diapath	070191	Dimensions extérieures : 40x26x7 mm (LxPxH)
Pince fine	VWR	232-1317	Nettoyer et autoclaver avant utilisation
Entonnoir	VWR	221-1861	Nettoyer et autoclaver avant utilisation
Peseuses hexagonales taille	M Sigma-Aldrich	Z708585	Hexagonale, polystyrène, 51 mm de diamètre intérieur, 64 mm de diamètre intérieur supérieur
Peseuses hexagonales taille S	Sigma-Aldrich	Z708577	Hexagonales, polystyrène, 25 mm Fond I.D., 38 mm Haut I.D.
Grands ciseaux chirurgicaux	VWR	233-1211	Nettoyer et autoclaver avant utilisation
Pince longue	VWR	232-0096	Nettoyer et autoclave avant utilisation
Pénicilline et streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333-100ml	Stabilisé, avec 10.000 unités de pénicilline et 10 mg de streptomycine/mL, 0.1 &mu ; m filtré. Conserver à -20°C. La solution  ; doit être aliquote dans des volumes de travail plus petits pour éviter des cycles répétés de gel/dégel Solution.
Pistolet pipette	Eppendorf	613-2795	Eppendorf Easypet® ; 3
Plateau en plastique	VWR	BELAH162620000	Plateau en plastique polypropylène résistant à la corrosion
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P9333	Poudre
Phosphate de potassium Monobasique	Sigma-Aldrich	P5665
Poudre Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich S7653		Poudre
Dodécylsulfate de sodium	Sigma-Aldrich	62862	Poudre
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	94046
Spatule	VWR	RSGA038.210	Nettoyer et autoclaver avant utilisation
Cuillère	VWR	231-1314	Nettoyer et autoclaver avant utilisation Barre d’agitation
	VWR	442-0362	Nettoyer et autoclave avant utilisation
Stir bar retriever	VWR	89026-262	Moulé en PTFE pur, approuvé par la FDA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Liquid

tubes stériles poudre à poudre