सीटू संकरण (ISH) में मल्टीप्लेक्स को वयस्क माउस के पूरे वागल गैंगलियोनिक परिसर में दो जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स और एक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के लिए टेप की कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वेगल एफेरेंट न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के सटीक नक्शे उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।
इस अध्ययन में माउस जुगलबंदी-नोज गैंगलिया के सीटू संकरण (ISH) में मल्टीप्लेक्स के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिसमें जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) की अभिव्यक्ति का पता लगाने पर विशेष जोर दिया गया है। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड जुगलबंदी-नोडोज गैंगलिया को आरएनएस्कोप तकनीक के साथ संसाधित किया गया था ताकि एक साथ दो प्रतिनिधि जीपीसीआरएस (कोलेसिस्टोकिनिन और घोरलिन रिसेप्टर्स) की अभिव्यक्ति का पता लगाया जा सके, जो या तो नोडोज (जोड़ी-जैसे होमोबॉक्स 2b, फोक्स2बी) या जुगुलर एफेरेंट न्यूरॉन्स (पीआर डोमेन जिंक फिंगर प्रोटीन 12, Prdm12) के एक मार्कर जीन के संयोजन में था। लेबल किए गए गैंगलिया को उपरोक्त टेप के वितरण और अभिव्यक्ति पैटर्न निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेज किया गया था। संक्षेप में, Phox2b afferent न्यूरॉन्स बहुतायत से कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर (Cck1r) व्यक्त करने के लिए पाया गया, लेकिन नहीं ghrelin रिसेप्टर (Ghsr) । Prdm12 afferent न्यूरॉन्स का एक छोटा सा सबसेट भी Ghsr और/या Cck1r व्यक्त करने के लिए पाया गया था । मल्टीप्लेक्स ISH के डिजाइन, प्रसंस्करण और व्याख्या में संभावित तकनीकी चेतावनी पर चर्चा की जाती है । इस लेख में वर्णित दृष्टिकोण वैज्ञानिकों को वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के सटीक नक्शे उत्पन्न करने में मदद कर सकता है।
वागल एफरेंट्स के सेल निकायों में जुगुलर, पेट्रोसल और नोडोज गैंगलिया1,2,3शामिल हैं। उनके अक्षों को एक साथ वेगस तंत्रिका की कई शाखाओं के माध्यम से क्रैनियोसर्विकल,वक्ष और पेट केक्षेत्रों 4,5,6, 7तक यात्राकरतेहैं। उनके आंत के अंत से, वैगल एफरेंट्स शारीरिक और हानिकारक उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का जवाब दे सकते हैं8,9,10। हालांकि, वैगल सेंसिंग में शामिल सिग्नलिंग अणुओं और रिसेप्टर्स का वितरण खराब विशेषता बना हुआ है। यह आंशिक रूप से इसलिए है क्योंकि वागल गैंगलिया, अपने छोटे आकार के बावजूद, रिसेप्टर्स का एक व्यापक स्पेक्ट्रम व्यक्त करते हैं, जिसमें बड़ी संख्या में जीपीसीआर8,11,12, 13शामिल हैं। इसके अलावा, vagal afferent न्यूरॉन्स स्वाभाविक विषम हैं और अलग आणविक प्रोफाइल14प्रदर्शित करते हैं । मामले को जटिल बनाने के लिए, माउस में जुगुलर, पेट्रोसल और नोडोज गैंगलिया संलग्न होते हैं, जिससे एक ही गैंगलियोनिक द्रव्यमान बन जाता है। अंत में, जानवरों के सबसेट में, नोडोज गैंगलियन सहानुभूति बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलियन15से जुड़ा हुआ है।
अतीत में, जांचकर्ताओं ने वैगल एफेरेंट न्यूरॉन्स16, 17, 18के न्यूरोकेमिकल मेकअप का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोहिस्टकेमिस्ट्री की ओर रुख किया है। जबकि मान्य एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री उपयोगी है, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययनों के परिणामों की सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, जीपीसीआर के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने के कईप्रयास19, 20,21,22,23,24,25,प्रमुख जांचकर्ताओं को यह निष्कर्ष निकालने में विफल रहे हैं कि जीपीसीआर के खिलाफ अधिकांश एंटीबॉडी अविश्वसनीय हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, कृंतक वैगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान 26 , 27 ,28,29में जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है । हालांकि, क्यूपीसीआर का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति की जांच स्थानिक जानकारी के नुकसान की कीमत पर होती है। विशेष रूप से, यह अनुमान नहीं लगाया जा सकता कि कितनी कोशिकाएं या कौन सी कोशिका प्रकार (एस) ब्याज के एक विशेष जीन को व्यक्त करती हैं (उदाहरण के लिए, नोडोज बनाम जुगुलर कोशिकाएं)। आवर्ती मुद्दों में आसन्न ऊतकों के साथ संदूषण और विच्छेदन15के दौरान वेगस तंत्रिका, बेहतर गर्भाशय ग्रीवा और जुगुलर गैंगलिया की चर लंबाई को शामिल करना भी शामिल है। उपरोक्त कठिनाइयों के परिणामस्वरूप, विवाद वैगल एफेरेंट न्यूरॉन्स में कई जीपीसीआर की अभिव्यक्ति और वितरण को घेरे हुए है। एक विशेष रूप से पेचीदा उदाहरण ghrelin रिसेप्टर (Ghsr) से संबंधित है। जबकि कुछ अध्ययनों में इस रिसेप्टर की व्यापक अभिव्यक्ति वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स30 , 31,32में पाई गई है , अन्य ने गस्सर एमआरएनए को नोडोज गैंगलियन 11,14में लगभग अज्ञेय पाया है । इसलिए वागल गैंगलियोनिक द्रव्यमान में जीएचएसआर एमआरएनए की विस्तृत मैपिंग की आवश्यकता है।
सीटू संकरण (ISH) में भी वैगल गैंगलियोनिक द्रव्यमान 7 , 11,12,33,34,35में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। चूंकि आरएनए-आधारित तकनीकें अधिकांश परिस्थितियों में एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों की तुलना में अधिक विश्वसनीय और विशिष्ट बनी हुई हैं36,37,ईश अध्ययन ने वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स के न्यूरोकेमिकल कोडिंग की बेहतर समझ के लिए मूल्यवान साबित किया है। बहरहाल, पारंपरिक ISH तकनीकों खुद चेतावनी के बिना नहीं कर रहे हैं । रेडियोधर्मी ईश संवेदनशील है लेकिन पृष्ठभूमि उत्पन्न करता है और38बोझिल रहता है । गैर रेडियोधर्मी ISH कम जटिल है, लेकिन यह भी कम संवेदनशील३८। इसके विपरीत, हाल ही में विकसित आरएनएस्कोप ईश विधि अत्यधिक संवेदनशील है और न्यूनतम पृष्ठभूमि39उत्पन्न करती है। वर्तमान अध्ययन ने माउस के वागल एफेरेंट न्यूरॉन्स में जीपीसीआर का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आरएनएस्कोप को लागू किया। हमने जीएचएसआर के वितरण की मैपिंग पर ध्यान केंद्रित किया और इसके वितरण की तुलना कोलेसिस्टोकिनिन रिसेप्टर (Cck1r) से की, एक और जीपीसीआर जिसे नोडोज गैंगलियन34में व्यक्त किया जाना जाता है। अंत में, दो प्रतिलेखन कारकों, बनती-जैसे होमोबॉक्स 2b (Phox2b) और पीआर डोमेन जिंक फिंगर प्रोटीन 12 (Prdm12), क्रमशः14,nodose और जुगलबंदी afferent न्यूरॉन्स के लिए चयनात्मक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया । Phox2b या Prdm12 की कल्पना किए बिना, निश्चितता के साथ जुगलबंदी बनाम नोडोज afferents की पहचान करना चुनौतीपूर्ण होगा। संभावित तकनीकी नुकसान भी लेख भर में चर्चा कर रहे हैं ।
ईश की तकनीक का आविष्कार 1960 के दशक के अंत में42के दशक में किया गया था । हालांकि, 1 9 80 के दशक के मध्य तक यह नहीं है कि इसे केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र43,44में एमआरएएनए का पता ल?…
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को एनआईएच ग्रांट #5P01DK119130-02 द्वारा वित्तपोषित न्यूरोएनाटॉमी/हिस्टोलॉजी/ब्रेन इंजेक्शन कोर द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक यूटी पश्चिमी लाइव सेल इमेजिंग सुविधा (डॉ फेल्प्स की अध्यक्षता में) और उसके कर्मचारियों (अभिजीत बुगडे और मार्सेल मेटलेन) की सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं, जो एनआईएच ग्रांट #1S10OD021684-01 द्वारा भाग में समर्थित है, जो एक एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट द्वारा भाग में समर्थित है, P30 CA142543।
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
-80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
HybEZ oven | hybridization oven | ||
Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
ImageJ-Fiji | NIH | ||
Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
User manual | ACD | 323100 USM | |
Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
ZEN Imaging Software | Zeiss |