Um modelo simplificado para transplante de válvula cardíaca heterotópica em roedores

Summary

Este protocolo descreve um método simples e eficiente para o transplante de folhetos de válvulas aórticas sob a cápsula renal para permitir o estudo da aoreatividade das válvulas cardíacas.

Abstract

Há uma necessidade clínica urgente de substituição de válvulas cardíacas que podem crescer em crianças. O transplante de válvula cardíaca é proposto como um novo tipo de transplante com potencial para fornecer válvulas cardíacas duráveis capazes de crescimento somático sem necessidade de anticoagulação. No entanto, a imunobiologia dos transplantes de válvulas cardíacas permanece inexplorada, destacando a necessidade de modelos animais estudarem esse novo tipo de transplante. Modelos anteriores de ratos para transplante de válvula aórtica heterotópica na aorta abdominal foram descritos, embora sejam tecnicamente desafiadores e caros. Para enfrentar esse desafio, um modelo de transplante subcapsular renal foi desenvolvido em roedores como um método prático e mais simples para estudar a imunobiologia do transplante de válvula cardíaca. Neste modelo, um único folheto de válvula aórtica é colhido e inserido no espaço subcapsular renal. O rim é facilmente acessível, e o tecido transplantado está firmemente contido em um espaço subcapsular que é bem vascularizado e pode acomodar uma variedade de tamanhos de tecido. Além disso, como um único rato pode fornecer três folhetos aórticos doadores e um único rim pode fornecer vários locais para tecido transplantado, menos ratos são necessários para um determinado estudo. Aqui, a técnica de transplante é descrita, proporcionando um avanço significativo no estudo da imunologia do transplante de válvulas cardíacas.

Introduction

Os defeitos cardíacos congênitos são a incapacidade congênita mais comum em humanos, afetando 7 em cada 1.000 crianças nascidas a cada^{ano 1}. Ao contrário de pacientes adultos em que várias válvulas mecânicas e bioprótesas são rotineiramente implantadas, pacientes pediátricos atualmente não têm boas opções para substituição de válvulas. Esses implantes convencionais não têm potencial para crescer em crianças beneficiárias. Como resultado, as re-operações mórbidas são necessárias para trocar os implantes da válvula cardíaca por versões sucessivamente maiores à medida que as crianças crescem, com crianças afetadas muitas vezes exigindo até cinco ou mais cirurgias de coração aberto em sua vida ^2,3. Estudos têm demonstrado que a liberdade de intervenção ou morte é significativamente ruim para bebês do que crianças mais velhas, com 60% dos bebês com válvulas cardíacas protéticas enfrentando a re-operação ou morte dentro de 3 anos após sua operação inicial⁴. Portanto, há uma necessidade urgente de entregar uma válvula cardíaca que possa crescer e manter a função em pacientes pediátricos.

Durante décadas, as tentativas de fornecer substituições crescentes de válvulas cardíacas foram centradas na engenharia de tecidos e células-tronco. No entanto, as tentativas de traduzir essas válvulas para a clínica não foram bem sucedidas até agora 5,6,7,8. Para lidar com isso, um transplante de válvula cardíaca é proposto como uma operação mais criativa para fornecer substituições crescentes de válvulas cardíacas com a capacidade de auto-reparar e evitar trombogênese. Em vez de transplantar todo o coração, apenas a válvula cardíaca é transplantada e crescerá com a criança receptora, semelhante a transplantes convencionais de coração ou um autógrafo pulmonar^{de Ross 9,10,11}. Após o funcionamento, as crianças receptoras receberão imunossupressão até que a válvula transplantada possa ser trocada por uma prótese mecânica de tamanho adulto quando o crescimento da válvula não for mais necessário. No entanto, a biologia do transplante de válvulas cardíacas permanece inexplorada. Portanto, modelos animais são necessários para estudar esse novo tipo de transplante.

Vários modelos de ratos foram descritos anteriormente para transplante heterotópico da válvula aórtica na aorta abdominal 12,13,14,15,16,17,18. No entanto, esses modelos são proibitivamente complicados, muitas vezes exigindo cirurgiões treinados para operar com sucesso. Além disso, são¹⁹ caros e demorados. Um novo modelo de rato foi desenvolvido para criar um modelo animal mais simples para estudar a imunobiologia dos transplantes de válvulas cardíacas. Folhetos de válvula aórtica simples são excisados e inseridos no espaço subcapsular renal. O rim é especialmente adequado para estudar a rejeição de transplantes, pois é altamente vascularizado com acesso a células imunes circulantes^20,21. Enquanto vários outros utilizaram um modelo subcapsular renal para estudar a biologia do transplante de outros transplantes de aloenxerto, como pâncreas, fígado, rim e córnea 22,23,24,25,26,27, esta é a primeira descrição do transplante de tecido cardíaco nesta posição. Aqui, a técnica de transplante é descrita, proporcionando um avanço significativo no estudo da imunologia do transplante de válvulas cardíacas.

Protocol

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal, seguindo o Guia Nacional de Atenção e Uso de Animais de Laboratório. 1. Informações sobre o modelo animal (Ratos) Use um microscópio operacional (ver Tabela de Materiais) com ampliação de até 20x para todos os procedimentos cirúrgicos. Use cepas síngênicas (como Lewis-Lewis) ou aogenéricas (como Lewis-Brown Noruega) para os transplantes, conforme necessário para o experimento. Us…

Representative Results

Uma representação gráfica do design experimental é fornecida para o modelo de rato (Figura 1). Além disso, uma raiz aórtica dissecada do coração do doador e um folheto de válvula aórtica individual preparado para implantação também é mostrado na Figura 2. Em seguida, uma imagem representativa da posição do folheto da válvula aórtica sob a cápsula renal para implantação é mostrada na Figura 3A e após 3, 7 e 28 …

Discussion

Importância e aplicações potenciais
Embora as válvulas cardíacas mecânicas e bioprotéticas sejam rotineiramente usadas em pacientes adultos que necessitam de substituição de válvulas, essas válvulas não têm potencial para crescer e, portanto, são subótimas para pacientes pediátricos. O transplante de válvula cardíaca é uma operação experimental projetada para fornecer substituições crescentes de válvulas cardíacas para recém-nascidos e bebês com doença cardíaca congênita….

Materials

0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x – 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C