نموذج نزيف تمزق الوريد الذيل في الهيموفيليا المخدرة بالكامل A الفئران
Summary
نموذج نزيف نقل الوريد الذيل المكرر (TVT) في الفئران المخدرة هو طريقة حساسة في الجسم الحي لتقييم نزيف الهيموفيليا. يستخدم نموذج نزيف TVT المحسن هذا فقدان الدم ووقت النزيف كنقاط نهاية ، مما يؤدي إلى تحسين النماذج الأخرى وتجنب الموت كنقطة نهاية.
Abstract
نماذج نزيف الذيل هي أدوات مهمة في أبحاث الهيموفيليا ، وتحديدا لتقييم آثار التخثر. تم تفضيل نموذج البقاء على قيد الحياة لانتقال الوريد الذيل (TVT) في العديد من الإعدادات بسبب الحساسية للجرعات ذات الصلة سريريا من الثامن ، في حين أن النماذج الأخرى المعمول بها ، مثل نموذج مشبك الذيل ، تتطلب مستويات أعلى من مركبات التخثر. لتجنب استخدام البقاء على قيد الحياة كنقطة نهاية ، قمنا بتطوير نموذج TVT يحدد فقدان الدم ووقت النزيف كنقاط نهاية وتخدير كامل خلال التجربة بأكملها. باختصار ، يتم وضع الفئران المخدرة مع الذيل المغمور في محلول ملحي معتدل (37 درجة مئوية) وجرعات مع مركب الاختبار في الوريد الجانبي الأيمن للذيل. بعد 5 دقائق ، يتم نقل وريد الذيل الجانبي الأيسر باستخدام دليل قالب ، ويتم إرجاع الذيل إلى محلول ملحي ، ويتم مراقبة جميع نوبات النزيف وتسجيلها لمدة 40 دقيقة أثناء جمع الدم. إذا لم يحدث أي نزيف في 10 دقائق أو 20 دقيقة أو 30 دقيقة بعد الإصابة ، يتم تحدي الجلطة بلطف عن طريق مسح القطع مرتين باستخدام قطعة شاش مبللة. بعد 40 دقيقة ، يتم قياس فقدان الدم كميا بكمية الهيموغلوبين التي تنزف في المياه المالحة. ينتج عن هذا الإجراء السريع والبسيط نسبيا نزيف ثابت وقابل للتكرار. بالمقارنة مع نموذج البقاء على قيد الحياة TVT ، فإنه يستخدم إجراء أكثر إنسانية دون المساس بالحساسية للتدخل الدوائي. علاوة على ذلك ، من الممكن استخدام كلا الجنسين ، مما يقلل من العدد الإجمالي للحيوانات التي تحتاج إلى تربية ، وفقا لمبادئ 3R. أحد القيود المحتملة في نماذج النزيف هو الطبيعة العشوائية للإرقاء ، والتي يمكن أن تقلل من قابلية تكرار النموذج. ولمواجهة ذلك، يضمن تعطيل الجلطة اليدوي تحدي الجلطة أثناء المراقبة، مما يمنع الإرقاء الأولي (الصفائح الدموية) من وقف النزيف. توفر هذه الإضافة إلى كتالوج نماذج إصابات النزيف خيارا لتوصيف تأثيرات التخثر بطريقة موحدة وإنسانية.
Introduction
النماذج الحيوانية ضرورية لفهم التسبب في الهيموفيليا وتطوير واختبار أنظمة العلاج والعلاجات. فأر العامل الثامن بالضربة القاضية (F8-KO) هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيموفيليا A 1,2. تلخص هذه الفئران السمات الرئيسية للمرض وقد استخدمت على نطاق واسع لتطوير العلاجات ، مثل منتجات FVIII المؤتلفة3،4،5 واستراتيجيات العلاج الجيني6،7.
هناك العديد من نماذج إصابات النزيف لتقييم الآثار الدوائية لمركبات مرقئ مختلفة في الجسم الحي. أحد نماذج التخثر هذه هو نموذج البقاء على قيد الحياة في نقل الوريد الذيل في الفئران 8,9,10,11,12,13,14 ، مما يقيس قدرة الفئران المحبة للهيموفيليا على البقاء على قيد الحياة بعد نقل الذيل. تم تقديم هذه الطريقة منذ أكثر من أربعة عقودمنذ 15 عاما ولا تزال تستخدم9،16،17. ومع ذلك ، يستخدم النموذج البقاء على قيد الحياة كنقطة نهاية ويتطلب مراقبة الحيوانات على مدى فترة تصل إلى 24 ساعة ، تكون خلالها الحيوانات واعية وبالتالي يمكن أن تعاني من الألم والضيق.
تم وصف نماذج النزيف ذات المدة الأقصر وتحت التخدير الكامل سابقا ، مثل نموذج مشبك الذيل (المعروف أيضا باسم طرف الذيل)8،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27،28 . ومع ذلك ، من أجل تطبيع كامل لفقدان الدم بعد تحدي النزيف ، تتطلب هذه النماذج جرعات من مركبات التخثر (على سبيل المثال ، FVIII) أعلى بكثير من تلك التي تدار سريريا29. نموذج إصابة مختلف تحت التخدير ، طريقة نزيف الوريد سافينا ، حساس لجرعات أقل من مركبات التخثر30 ولكنه يتطلب مستوى عاليا من تدخل المجرب حيث يجب تعطيل الجلطات بشكل متكرر (على عكس 3 مرات في النموذج المعروض).
ومن شأن التوحيد القياسي نحو بروتوكول مشترك لاختبار مركبات جديدة مسببة للتخثر أن يسهل إلى حد كبير مقارنة البيانات بين المختبرات 31،32،33. في نماذج TVT ، لا يوجد حتى الآن اتفاق مشترك على نقاط النهاية المدروسة (فقدان الدم 7,26 ، وقت النزيف 9,34 ، ومعدل البقاء على قيد الحياة 35,36) ، ويختلف الطول التجريبي بين الدراسات13.
هدفنا الأساسي هو وصف وتوصيف نموذج محسن مع قابلية عالية للتكرار ، وإمكانية الدراسة عند الطلب بالإضافة إلى العلاج الوقائي ، والحساسية للتدخل الدوائي المكافئ لنموذج البقاء على قيد الحياة ، ولكن لا تستخدم الموت أو الاقتراب من الموت كنقاط نهاية. من أجل الحد من الألم والضيق ، يجب ألا تكون الحيوانات واعية أثناء النزيف ويجب تنفيذ نقطة نهاية أكثر أخلاقية37.
يتم إجراء نماذج مشبك الذيل بشكل عام في أحد الخيارين ، إما بتر طرف الذيل ، على سبيل المثال ، بتر 1-5 مم18،19،20،21،23،24 أو ، في متغير أكثر شدة ، يتم نقله بقطر ذيل حوالي 1-3 مم8،22،25 . هذا يسبب نزيفا شريانيا وريديا مشتركا ، حيث يتم عادة قطع الأوردة الجانبية والظهرية والشريان البطني ، وبشكل عام ، كلما زاد البتر ، انخفضت الحساسية لمركب التخثر. علاوة على ذلك ، نظرا لأن طرف الذيل مبتور ، فإن الإصابة الشريانية الوريدية مكشوفة دون أي أنسجة متعارضة. وبالتالي ، على الأقل من الناحية النظرية ، فإنه يختلف عن نزيف الهيموفيليا الأكثر شيوعا.
كما يوحي الاسم ، يصاب الوريد فقط في نماذج نقل الوريد الذيل كما هو موضح في هذه الورقة ، مما يؤدي إلى نزيف وريدي حصري. نظرا لأن الوعاء غير مقطوع بالكامل ، فمن المتوقع أن تكون الإصابة أصغر مما كانت عليه في نماذج البتر ، ويتم الاحتفاظ بالأنسجة المحيطة بالقطع ، والتي قد تلتصق بها الجلطة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك انخفاض في ضغط الدم في الوريد بدلا من الشريان. تساهم هذه العوامل في زيادة الحساسية بالنسبة لنماذج البتر ، بحيث يمكن تحقيق تطبيع النزيف بجرعات ذات صلة سريريا من العلاج البديل ، على سبيل المثال ، مع rFVIII في الهيموفيليا A ، وهو أمر مفيد لتقييم حجم ومتانة آثار العلاج بالتخثر26،38،39.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الطريقة المحسنة لنقل الوريد الذيل (TVT) لها العديد من المزايا مقارنة بطريقة البقاء على قيد الحياة TVT. يتم تخدير الحيوانات بالكامل طوال مدة الدراسة ، مما يجعل التعامل مع الفئران أسهل ويزيد من رفاهية الحيوان. علاوة على ذلك ، على عكس نموذج البقاء على قيد الحياة TVT ، فإن المراقبة بين عشية وضحا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم الاعتراف بإستر بلوم وتوماس نيغارد لدعمهما في قياسات FVIII في البلازما. يتم التعرف على بو ألستيد لرسم وتصنيع القالب وقطع الكتل.
Materials
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II – A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice – characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J. Haemophilias A and B. Lancet. 361 (9371), 1801-1809 (2003).
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts – Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
