Svansvenens transsektionsblödningsmodell i helt sövda hemofili A-möss

Summary

Den raffinerade svansvenstranssektionstranssektionsmodellen (TVT) hos sövda möss är en känslig in vivo-metod för bedömning av hemofil blödning. Denna optimerade TVT-blödningsmodell använder blodförlust och blödningstid som slutpunkter, förfinar andra modeller och undviker döden som slutpunkt.

Abstract

Svansblödningsmodeller är viktiga verktyg inom hemofiliforskning, speciellt för bedömning av prokoagulerande effekter. Överlevnadsmodellen för svansvenstranssektion (TVT) har föredragits i många miljöer på grund av känslighet för kliniskt relevanta doser av FVIII, medan andra etablerade modeller, såsom svansklämmodellen, kräver högre nivåer av prokoagulerande föreningar. För att undvika att använda överlevnad som slutpunkt utvecklade vi en TVT-modell som fastställde blodförlust och blödningstid som slutpunkter och full anestesi under hela experimentet. I korthet placeras bedövade möss med svansen nedsänkt i tempererad saltlösning (37 ° C) och doseras med testföreningen i den högra laterala svansvenen. Efter 5 minuter transekteras den vänstra laterala svansvenen med hjälp av en mallguide, svansen återförs till saltlösningen och alla blödningsepisoder övervakas och registreras i 40 minuter medan blodet samlas in. Om ingen blödning inträffar vid 10 min, 20 min eller 30 min efter skada, utmanas blodproppen försiktigt genom att torka av snittet två gånger med en våt gasbinda. Efter 40 minuter kvantifieras blodförlusten av mängden hemoglobin som blöder in i saltlösningen. Denna snabba och relativt enkla procedur resulterar i konsekventa och reproducerbara blödningar. Jämfört med TVT-överlevnadsmodellen använder den ett mer humant förfarande utan att kompromissa med känsligheten för farmakologisk intervention. Dessutom är det möjligt att använda båda könen, vilket minskar det totala antalet djur som behöver födas upp, i enlighet med principerna för 3R: er. En potentiell begränsning i blödningsmodeller är hemostasens stokastiska natur, vilket kan minska modellens reproducerbarhet. För att motverka detta säkerställer manuell proppstörning att blodproppen utmanas under övervakningen, vilket förhindrar primär (trombocyt) hemostas från att stoppa blödningen. Detta tillägg till katalogen över blödningsskademodeller ger möjlighet att karakterisera prokoagulerande effekter på ett standardiserat och humant sätt.

Introduction

Djurmodeller är viktiga för att förstå patogenesen av hemofili och utveckla och testa behandlingsregimer och terapier. Faktor VIII knock-out mus (F8-KO) är en allmänt använd modell för studier av hemofili A ^1,2. Dessa möss rekapitulerar viktiga egenskaper hos sjukdomen och har använts i stor utsträckning för utveckling av behandlingar, såsom rekombinanta FVIII-produkter ^3,4,5 och genterapistrategier ^6,7.

Det finns olika blödningsskademodeller för att utvärdera de farmakologiska effekterna av olika hemostatiska föreningar in vivo. En av dessa koagulationsmodeller är överlevnadsmodellen för svansventranssektion hos möss 8,9,10,11,12,13,14, som mäter förmågan hos hemofila möss att överleva exsanguination efter svanstranssektion. Denna metod introducerades för mer än fyra decennier sedan¹⁵ och används fortfarande ^9,16,17. Modellen använder dock överlevnad som slutpunkt och kräver observation av djuren under en period på upp till 24 timmar, under vilken djuren är medvetna och därmed kan uppleva smärta och nöd.

Blödningsmodeller med kortare varaktighet och under full anestesi har beskrivits tidigare, såsom svansklämmodellen (även känd som svansspetsen)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . För en fullständig normalisering av blodförlust efter blödningsutmaningen kräver dessa modeller dock doser av prokoagulerande föreningar (t.ex. FVIII) mycket högre än de som administreras kliniskt²⁹. En annan skademodell under anestesi, vena saphena-blödningsmetoden, är känslig för lägre doser av prokoagulerande föreningar³⁰ men kräver en hög nivå av experimentintervention eftersom blodpropparna måste störas ofta (i motsats till 3 gånger i den presenterade modellen).

Standardisering mot ett gemensamt protokoll för att testa nya prokoagulerande föreningar skulle i hög grad underlätta datajämförelse mellan laboratorier 31,32,33. I TVT-modeller finns det ännu ingen gemensam överenskommelse om studerade effektmått (blodförlust ^7,26, blödningstid ^9,34 och överlevnad ^35,36), och experimentell längd varierar mellan studier¹³.

Vårt primära mål är att beskriva och karakterisera en optimerad modell med hög reproducerbarhet, möjligheten att studera on-demand såväl som en profylaktisk behandling, känslighet för farmakologisk intervention motsvarande överlevnadsmodellen, men ändå inte använda död eller nära-död som endpoints. För att minska smärta och ångest bör djuren inte vara vid medvetande vid avblodning och ett mer etiskt effektmått behöver implementeras³⁷.

Svansklämmodeller utförs vanligtvis i en av två varianter, antingen amputerar svansspetsen, t.ex. amputation av 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 eller, i en svårare variant, transekterad med en svansdiameter runt 1-3 mm ^8,22,25 . Detta orsakar en kombinerad arteriovenös blödning, eftersom laterala och dorsala vener och ventral artär vanligtvis är avskurna, och i allmänhet, ju större amputationen är, desto lägre är känsligheten för en prokoagulerande förening. Dessutom, eftersom svansspetsen amputeras, exponeras den arteriovenösa skadan utan någon motsatt vävnad; således, åtminstone i teorin, är det olikt de vanligaste hemofila blödningarna.

Som namnet antyder skadas endast venen i svansvenens transsektionsmodeller som beskrivs i detta papper, vilket resulterar i en uteslutande venös blödning. Eftersom kärlet inte är helt avskuret förväntas skadan vara mindre än i amputationsmodellerna, och vävnaden runt snittet, som en blodpropp kan fästa vid, behålls. Dessutom finns det lägre blodtryck i venen i motsats till artären. Dessa faktorer bidrar till en ökad känslighet i förhållande till amputationsmodeller, så att normalisering av blödning kan uppnås med kliniskt relevanta doser av substitutionsbehandling, t.ex. med rFVIII vid hemofili A, vilket är användbart för att utvärdera storleken och hållbarheten av effekterna av prokoagulantiabehandling 26,38,39.

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll har godkänts av djurskyddsorganet vid Novo Nordisk A/S och den danska djurförsöksinspektionen, det danska ministeriet för livsmedel, jordbruk och fiske. Den optimerade 40-minutersmetoden inkluderar anestesi och doseringstid i designen (figur 1). Hemofila möss av båda könen mellan 10-16 veckors ålder krävs för denna procedur. 1. Förberedelser inför studien Förbered doseringslösningarna i rätt k…

Representative Results

För att bedöma tillämpligheten av den optimerade modellen utfördes en studie på F8-KO (C57BL genetisk bakgrund) möss administrerade med en kommersiellt tillgänglig rekombinant faktor VIII-ersättningsterapi (rFVIII); fyra olika doser testades: 1 IE/kg, 5 IE/kg, 10 IE/kg och 20 IE/kg. Dessutom testade vi motsvarande fordons (negativ) kontroll i F8-KO-möss och vildtyp (WT) -grupp med C57BL-möss som en positiv kontrollgrupp för att bedöma svarsområdet i modellen. Efter det optimerade …

Discussion

Denna optimerade metod för svansvenstranssektion (TVT) har flera fördelar jämfört med TVT-överlevnadsmetoden. Djuren är helt sövda under hela studietiden, vilket underlättar mushanteringen och ökar djurens välbefinnande. Vidare, till skillnad från TVT-överlevnadsmodellen, krävs inte observation över natten, och denna optimerade modell erbjuder möjligheten att mäta blodförlust och observera den exakta blödningstiden över 40 minuter. Längre blödningsperioder hos medvetna djur kan också orsaka dödsfal…

Materials

#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo