Denna artikel beskriver metoden för mitokondriell tidsfördröjning av astrocyt kulturer utrustade med MitoTimer biosensor och den resulterande multiparametrisk analys av mitokondriell dynamik, rörlighet, morfologi, biogenesis, redox tillstånd och omsättning.
Medan mycket uppmärksamhet har ägnats åt mitokondriella förändringar på neuronal nivå, visar nya bevis att mitokondriell dynamik och funktion i astrocyter är inblandade i kognition. Denna artikel beskriver metoden för time-lapse imaging av astrocyt kulturer utrustade med en mitokondriell biosensor: MitoTimer. MitoTimer är ett kraftfullt och unikt verktyg för att bedöma mitokondriell dynamik, mobilitet, morfologi, biogenes och redox tillstånd. Här presenteras de olika förfarandena för kultur, bildförvärv och efterföljande mitokondriell analys.
Astrocyter är kritiska aktörer i upprätthållandet av hjärnans homeostas. De är kanske mest kända för att ha betydande strukturella roller i hjärnan, som en del av blod – hjärnbarriären1 och genom att stödja nervceller och synapser i hela hjärnan2. Astrocyt stöd av nervceller är både strukturella3 ochmetaboliska 4,5, med astrocyter främja neurogenes och synaptogenes samtidigt som de ger viktiga metaboliter som laktat till aktiva nervceller4,6,7. Utöver rollen som strukturellt stöd är astrocyter aktiva celler som deltar i Ca2 + signalering och buffring (inklusive spontan mitokondriell Ca2 + tillströmningar)8,9, K+ buffring10, och kan anpassa sig och reagera på hjärnans behov i tider av skada11,12 . Eftersom astrocyter är sådana dynamiska celler har de robusta energibehoven, vilket kräver ett effektivt mitokondriellt nätverk. Dessa mitokondrier har också en avgörande roll för att buffra alltför reaktiva syrearter (ROS)13. Förutom sina individuella eller lokala roller som energiproduktion och ROS-buffring fungerar mitokondrier som ett nätverk14. I den meningen upprätthåller de jämvikt mellan fissioning och fusioning mitokondrier, som representerar nya / reducerade mitokondrier och äldre/ oxiderade mitokondrier, respektive15. Det övergripande redoxtillståndet för en cell kan mätas av redoxtillståndet för mitokondriellt nätverk. I patologi är detta en kritisk information som kan kasta ljus över vilka celler som kanske inte fungerar optimalt.
Under de senaste åren har många sensorer utvecklats för att studera dynamiken och funktionerna hos mitokondrier i celler. Till exempel används sensorer som mäter energiutbyte (ATP), redoxtillstånd (NADH/NAD+, ROS) och enzymatisk funktionalitet (cAMP, Ca2+, Zn2+) för närvarande i studien av mitokondriell funktion16. Bland dem tillåter MitoTimer att följa förändringarna i mitokondriell morfologi (storlek, form, yta), rörlighet (hastighet, förskjutning) och dynamik (fusionering och fissioning händelser), liksom den totala mitokondriella omsättningshastigheten och redox tillstånd. MitoTimer är ett muterat rött fluorescerande protein, drFP58317, med en mitokondriell signal från underenhet VIII av humant cytokrom c oxidas18,19 för att visualisera nyligen syntetiserade mitokondrier i grönt (488 nm) och oxiderat mitokondri i rött (555 nm). Med hjälp av det gröna (488 nm) och röda (555 nm) fluorescensförhållandet möjliggör samtidig utvärdering av enskilda mitokondrier, deras morfologianalys, fusion/fissionshändelser och redox tillståndshistoria20,21. Denna unika egenskap kan användas för att undersöka många vetenskapliga frågor om mitokondriers fysiologiska och patologiska roller och är därför mycket lovande för att avslöja de underliggande mekanismerna för mitokondriell dynamik inom många olika celltyper.
Vi utvecklade nyligen en ny lentiviral vektor (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, nedan kallad LV-G1-MitoTimer) för att studera mitokondriers dynamik och funktioner specifikt i astrocyter in vitro och in vivo22. LV-G1-MitoTimer använder en trunkerad version av gliafibrillärsyrans (GFAP) promotor gfaABC1D, med en B3-förstärkare (gfaABC1D(B3), nedan kallad G1) i kombination med det tidigare beskrivna miR124T neuronala detargetingssystemet23. Det tillåter exklusivt uttryck av den mitokondriella biosensorn i astrocyter in vitro och in vivo22. Presenteras här är de olika stegen för att utföra en kultur av råtta hippocampal astrocyter och utrusta dem med LV-G1-MitoTimer biosensor, liksom de olika mikroskopi steg för att följa beteendet hos astrocyt mitokondrier under flera på varandra följande timmar / dagar.
Här föreslås en ny metod för att longitudinellt följa dynamiken och omsättningen hos mitokondriellt system i en odlad astrocyt. Till skillnad från en timelapse-strategi på en fast grupp celler eller en enskild cell i taget (oftast används i litteraturen)24,25, kan forskare följa utvecklingen av mitokondriellt system under flera dagar på samma enskilda celler. I motsats till en enda väl levande avbildning där höga nivåer av ljusexponering krävs, och valet av många enskilda celler är mindre genomförbart, drar den föreslagna metoden nytta av detta mikroskops förmåga att avbilda flera olika celler i olika områden i en brunn och att komma tillbaka till samma celler vid olika tidpunkter för att avbilda dem igen. Tack vare normalisering till en baslinje som utförs för varje uppmätt kriterium på varje cell av intresse, tar det hänsyn till mitokondriellt systems komplexitet och undersöker effekten av behandling på varje cell i förhållande till sin egen baslinjebild. Mikroskopets förmåga att självständigt utföra denna typ av avbildning på upp till 16 brunnar åt gången (avbildning 5 celler per brunn) gör det möjligt att ta vederbörlig hänsyn till heterogeniteten hos mitokondriellt system under analysen utan den experimentella variabilitet som följer med avbildning av olika tillstånd på olika dagar.
Kvaliteten på kulturerna, nivåerna av virusinfektioner som uttrycker biosensorn LV-G1-MitoTimer, typen av mikroskop och mål och valet av lämpliga celler är kritiska variabler som måste förbli så konsekventa som möjligt i detta protokoll. Celltätheten, typen av vektor och virustitrar kan anpassas enligt frågan. Även om tidigare arbete visar att LV-G1-MitoTimer-uttrycket inte har några skadliga konsekvenser för mitokondriell funktion och dynamik21,22,26,27, är det viktigt att kontrollera att koncentrationen inte är giftig för cellerna (till exempel kontrollera det totala antalet celler i kontrollbrunnen). Eftersom ett enda fokalplan används bör astrocyter vara: (1) så plana som möjligt, (2) isolerade från andra märkta celler (för att förenkla analysen vid förskjutning i skålen) och (3) med höga fluorescensnivåer. Eftersom celler i kultur kan vara mycket varierande i morfologi, kan mitokondriellt system vara mycket heterogent. I detta sammanhang kompenserar analys av ROI (och inte hela cellen) för vissa problematiska regioner, till exempel de perinukleära regionerna, och minskar variabiliteten. Det är viktigt att göra baslinjen på relativt likartade celler och ta prov på så många celler som möjligt. Följaktligen är höginnehållsförvärv och analysmikroskop idealiska. Under denna longitudinella övervakning är det också viktigt att inte överexponera cellerna till ljus för att undvika biosensorblekning.
Denna avbildningsmetod är inte utan sin komplexitet, och i hela protokollet ingår flera anteckningar, som tar hänsyn till felsökning som gjorts under tidigare tester med mikroskopet. Valet av plattbeläggning som används beror till exempel på den avsedda analysen, men rekommendationer för de mest lämpliga valen för astrocyt primära kulturer har inkluderats. Dessutom bör bildförvärv utföras på minst 5 celler per tillstånd på grund av intercellulär variabilitet. Mer specifikt kommer vissa celler som väljs vid baslinjeavbildning att dö, vissa kommer att flytta ut ur ramen för det tilldelade bildförvärvsområdet, och vissa kommer att ändra sin morfologi, vilket gör mitokondrierna mycket svåra att individualisera i analys. Att avbilda många celler från början ökar sannolikheten för en tillräckligt stor provstorlek på celler för att analysera i slutet av experimentet. Förutom de mer komplexa aspekterna av denna bildteknik finns det några direkta begränsningar när det gäller vem som kan dra nytta av denna typ av avbildning och analys. För att dra full nytta av automatiseringen av bildförvärv måste mikroskopet som används ha ett autofokussystem som kan hantera tidsintervallen mellan bilderna (dvs. var tredje s i detta protokoll) och kan konsekvent fokusera på cellen i fråga innan varje bild tas. Utan JOBS-programvaran, som automatiserar hela bildförvärvsprocessen, blir denna metod dessutom mödosam och potentiellt omöjlig beroende på antalet celler som avbildas eftersom det skulle kräva att varje cell manuellt hittar och avbildas igen vid lämplig tidpunkt. Slutligen är denna avbildningsmetod inte immun mot frågan om fotobleaching. Av denna anledning, som med alla långsiktiga förvärvsmetoder, är det viktigt att välja fluorescerande markörer som är mindre mottagliga för fotobleaching och att skräddarsy bildförvärv för att undvika denna fråga så mycket som möjligt.
Denna teknik skiljer sig från andra som för närvarande används på ett avgörande sätt. Till skillnad från andra timelapse-studier kräver denna teknik inte avbildning på samma position i brunnen hela tiden, och kräver inte heller manuell rörelse av plattan för att avbilda andra områden. Detta ger forskare möjlighet att avbilda många celler under många förhållanden inom en tidsram på 24 timmar. Följaktligen ger förmågan att utföra denna avbildning och analys på många celler i varje brunn samma befolkningsinformation som man skulle få genom att i stort studera en stor grupp celler samtidigt som man dessutom tillhandahåller specifika åtgärder från varje cell som avbildas. Även om vissa specificiteter för denna metod kanske inte gäller för andra bildförvärvsmetoder (beskrivs ovan), överväger fördelarna komplikationerna med den typ av analys som är möjlig efter förvärvet. Denna teknik gör det möjligt för forskare att se de exakta konsekvenserna av olika behandlingar på mitokondriellt system, och följaktligen på de odlade astrocyterna.
Dessutom är denna metod mycket anpassningsbar till många olika vetenskapliga frågor om mitokondriellt beteende och roller i specifika sammanhang. Här behandlar det skisserade protokollet specifikt odlade astrocyter. Många andra celltyper kan dock användas, och de behandlingar som kan testas begränsas endast av de frågor som undersöks. Denna typ av avbildning har potential att främja den kollektiva kunskapen och förståelsen av mitokondriellt beteende, de underliggande mekanismerna som leder till mitokondriell dysfunktion och effekterna av många patologier på den medfödda dynamiken som finns i olika typer av celler.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av ett Synapsis Foundation-stipendium som tilldelades K.R. och Lausanne University Hospital (CHUV). Författarna tackar Nikon för deras hjälp, särskilt J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |