Detta protokoll presenterar en metod för att öka procent tumörinnehållet i formalinfixerade paraffininbäddade vävnadsprover.
Förekomsten av förorenande icke-tumörvävnader i formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnader kan kraftigt undergräva genomiska studier. Här beskriver vi makrodissektion, en metod som är utformad för att öka det procentuella tumörinnehållet i ett vävnadsprov genom att ta bort och eliminera oönskad vävnad innan nedströms nukleinsyraextraktioner utförs. FFPE-vävnadsblock delades för att producera 4-5 μm glidmonterade vävnadssektioner. En representativ sektion lämnades in för färgning av hematoxylin och eosin (H&E) och granskades därefter av en styrelsecertifierad patolog. Under granskningen identifierade och markerade patologen regionerna av tumörvävnad i H&E. När den var klar användes den markerade H&E för att styra resektion av de seriella oskadade sektionerna från samma vävnadsblock. För att demonstrera effekterna av makrodissektion kördes RNA extraherat från matchade makrodissekerade och icke-dissekerade diffusa stora B-celllymfom (DLBCL) på en digital genuttrycksanalys som kan bestämma DLBCL-subtyp och BCL2-translokationsstatus. Resultaten visade att makrodissektion ändrade subtyp eller BCL2-translokationsstatusanrop i 60% av de undersökta proverna. Sammanfattningsvis är makrodissektion en enkel och effektiv metod för att utföra tumöranrikning före nukleinsyraextraktioner, vars produkt sedan med säkerhet kan användas i nedströms genomiska studier.
Formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnader, som samlas in som en del av den normala kliniska diagnostiska processen och behålls i kliniska vävnadsförråd, utgör en stor resurs för mänsklig forskning, inklusive cancerforskning1. I takt med att vår förståelse av mänskliga sjukdomar fördjupas blir det allt tydligare att sjukdomar, som tidigare troddes vara enskilda enheter baserade på morfologiska och immunofenotypiska egenskaper, i själva verket består av distinkta molekylära subtyper som kräver molekylära subtypningsmetoder. Följaktligen har högkänsliga genomiska analyser som kan urskilja dessa subtyper blivit allt viktigare2. Även om FFPE-vävnader är kända för att vara dåligt kompatibla med genomiska tekniker på grund av fixeringsrelaterade problem, när teknik och protokoll utvecklas, blir dessa tekniker alltmer kompatibla med detta kliniskt allestädes närvarande vävnadsformat 3,4,5. FFPE-vävnader är emellertid ofta blandningar av tumör- och icke-tumörvävnadsmaterial, där närvaron av icke-tumörmaterial ofta är oönskad och kan, om den förekommer i en hög andel, avsevärt undergräva och påverka resultaten av genomiska analyser6. Faktum är att ett lägsta tumörinnehåll på 60% ofta används för sådana analyser, där vävnader som inte når upp till denna tröskel kan uteslutas, trots att de annars uppfyller studiekriterierna7. Detta kan vara särskilt problematiskt i miljöer med sällsynta sjukdomar, där patientvävnader är värdefulla och svåra att samla in i stort antal.
Makrodissektion är en metod som minimerar effekterna av lågt tumörinnehåll genom att minska mängden normal vävnad3. Avlägsnandet av sådant förvirrande icke-tumörmaterial före nukleinsyraextraktion kan avsevärt öka tumörprocentinnehållet och därmed tumörrenheten hos de extraherade nukleinsyrorna. Vävnadsresektion är kritiskt beroende av expert patologisk granskning, där tumörregionen identifieras och cirklas på en nygenererad hematoxylin och eosin (H&E) färgad vävnadssektion av en styrelsecertifierad patolog8. Den inringade H&E används sedan för att styra avlägsnandet och insamlingen av oönskade respektive målvävnader. Detta protokoll beskriver stegen för makrodissektion från patologisk granskning till vävnadsskörd som utförs vid AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory vid Mayo Clinic.
FFPE-vävnader är ofta heterogena blandningar av tumör- och icke-tumörvävnader. Högkänsliga genomiska tester blir allt vanligare i både kliniska och forskningsmiljöer men kan förvirras av förekomsten av förorenande icke-tumörvävnad. Faktum är att ett lägsta tumörinnehåll på 60% ofta rekommenderas för genomiska studier. Procentuell tumör kan bestämmas av vävnadsområdet som upptas av tumörmaterialet eller av andelen tumörceller i vävnaden. Även om tumör efter område är ett vanligt mått för tumörrenhet, visar det inte alltid en korrekt beskrivning av vävnaden. Tänk på två vävnader, båda med 1000 celler, varav 500 är tumörceller. I vävnad A är de 500 icke-tumörcellerna stromaceller med liknande volymer som tumörcellen. I denna vävnad kan andelen tumör betraktas som 50% av både cellularitet och område. I vävnad B är de 500 icke-tumörcellerna fettceller med volymer som är 4x tumörcellens. I denna vävnad är den procentuella tumören fortfarande 50% av cellularitet men 20% efter område. En tredje vävnad, vävnad C, består av 500 tumörceller plus 400 fettceller och 800 stromaceller med volymer som är 4x respektive 0,5x tumörcellernas. Givet 100 fettceller motsvarar volymen av 800 stromaceller, är den procentuella tumören i vävnad C 29% av cellularitet (500/1700) men fortfarande 20% efter område. Vävnad D består också av tumör-, fett- och stromacellerna med volymförhållanden på 1x, 4x och 0,1x. Antalet celler är emellertid 400, 10 respektive 720. Således är den procentuella tumören i vävnad D 35% av cellularitet (400/1130) men 78% efter område. Dessa exempel är alltför förenklade och återspeglar inte verkliga vävnadskompositioner utan förmedlar tydligt vikten av vävnadssammansättning och skillnaden mellan tumörinnehåll per område och cellitet. Viktigt, när det gäller att berika tumörinnehåll för nedströms nukleinsyrautvinning, är tumörcellitet det viktigaste attributet på grund av den ökade förvirrande potentialen att extrahera genomiskt material från fler icke-tumörceller än tumörceller. Detta understryker inte bara behovet av att bedöma tumörinnehållet i vävnader när det gäller procentuell cellularitet utan också behovet av att skära ut oönskad vävnad för att minimera eventuella negativa effekter av icke-tumörvävnaden. Det finns flera metoder tillgängliga för vävnadsanrikning, varav de viktigaste är makrodissektion och mikrodissektion.
Makrodissektion, metoden som beskrivs i detta protokoll, är relativt snabb, enkel och kräver inte kostsam eller specialiserad utrustning. Även om makrodissektion kan förbättra tumörinnehållet kraftigt är det viktigt att förstå att det inte helt eliminerar icke-tumörmaterial. Syftet med makrodissektion är att berika vävnaden av intresse tillräckligt genom uteslutning av oönskad vävnad för att minska “bruset” som härrör från oönskad vävnad, vilket i sin tur kan förbättra signalen av intresse från vävnaden av intresse. Således är makrodissektionsmedierad tumöranrikning ett sätt att förbättra signal-brusförhållandet för att bättre upptäcka markörer av intresse, särskilt tumörspecifika molekylära markörer med låg överflöd eller dåligt uttryck. Makrodissektion har dock begränsningar på grund av bristen på precision som erbjuds av grova verktyg som rakblad och är mottaglig för precisionsproblem som härrör från linjetjockleken på patologens markör, liksom potentiella fel vid spårning av patologernas H&E-avgränsningar. Som nämnts ovan är det inte möjligt att uppnå 100% tumörrenhet på grund av närvaron av inneboende och tumörinducerande stromaelement (dvs bindväv, stromala fibroblaster, blodkärl, godartade reaktiva lymfocyter, makrofager) inbäddade i själva tumören. Faktum är att många invasiva eller diffust infiltrativa maligniteter inducerar ett robust desmoplastiskt stromalt svar, vilket resulterar i kluster av tumörceller som är intimt blandade med stromala fibroblaster och andra icke-neoplastiska celltyper; där tumörer associerade med detta stromala reaktionsmönster, såsom bukspottkörtelcancervävnader21, kan dra mer nytta av digitalt styrd mikrodissektion snarare än manuell makrodissektion.
Manuell mikrodissektion utförs under ett mikroskop för att underlätta identifiering, dissektion och isolering av vävnadsspecifika celler eller populationer med hjälp av en nål eller skalpell och har fördelen av ökad precision jämfört med makrodissektion22. Manuell mikrodissektion är emellertid en mödosam process som saknar den finess som behövs för komplexa vävnader med lågt tumörinnehåll eller invecklade funktioner som är oförenliga med manuell dissektion. Sådana vävnader kan dissekeras med hjälp av automatiserade metoder med hög precision som laserfångningsmikrodissektion. Faktum är att digitalt styrd mikrodissektion har visat sig ge högre procentuellt tumörinnehåll jämfört med manuell makrodissektion i bukspottkörtelcancervävnader23. Nackdelarna med dessa automatiserade metoder med hög precision, såsom behovet av specialiserad, dyr utrustning och högutbildade individer, har dock hindrat dess införlivande i arbetsflöden. som jämförde effekterna av makrodissektion och laserfångningsmikrodissektion (LCM) på genuttrycksprofilering fann att LCM-prover hade låga totala RNA-utbyten (30 ng genomsnitt) och krävde två omgångar av mRNA-förstärkning för att uppfylla cDNA-bibliotekets förberedelseinmatningströskel24. Författarna fann att de resulterande LCM-genuttrycksprofilerna påverkades av omgångarna av mRNA-förstärkning mer än makrodissekerade profiler påverkades av icke-tumörstromala bidrag och drog slutsatsen att makrodissektion kunde användas på ett adekvat sätt för att generera tillförlitliga genuttrycksdata24.
En betydande fördel med NanoString digital genuttrycksprofilering, särskilt när man arbetar med mycket försämrat FFPE-härledd RNA, är att det inte kräver enzymatiska beroende processer som RNA-förstärkning eller beredning av cDNA-bibliotek. Analyser är emellertid vanligtvis optimerade för ingångar mellan 50-300 ng av totalt RNA25,26, vilket, baserat på resultaten från de Bruin et al.24, kanske inte är kompatibelt med mikrodissekerade vävnader utan att öka vävnadsingången; en ogynnsam efterfrågan i en tid där vävnadsprover alltmer samlas in som små biopsier snarare än kirurgiska resektioner. RNA-ingångarna som användes för DLBCL90-analysen varierade från 68,5-300 ng för både makrodissekerade och icke-dissekerade vävnader. Resultaten visar att makrodissektion resulterade i samtalsförändringar i 60% av de undersökta proverna och att dessa förändringar observerades oberoende av RNA-inmatning av de makrodissekerade proverna. COO-sannolikheten för den låga RNA-ingången inkräktade dock på COO GCB / UNC-sannolikhetsanropströskeln, där tröskelvärdena är 0 till 0,9 till 1,0 för ABC-samtal20. De viktigaste DLBCL COO-undertyperna är GCB och ABC, som utgör 41% och 44% av alla DLBCL-fall, där UNC representerar en mellanliggande grupp av de två och ABC är de mest aggressiva20,27. Även om COO-samtalsändringen vid makrodissektion av prov C inte orsakade en uppriktig förändring av COO-subtypen från GCB till ABC, kan förändringen från GCB till UNC föreslå en övergång till en mer aggressiv sjukdom. Dessutom tyder nyligen genomförda studier på att UNC-subtypen inte bara är en mellanliggande subtyp och att den potentiellt kan ha subtypspecifika terapeutiskt exploaterbara egenskaper28. På samma sätt orsakade makrodissektion av proverna A och E inte uppriktiga förändringar i DHITsig-samtal från DH-negativa till DH-positiva, eller vice versa. Rörelserna för ett GCB-prov (prov A) från NEG till UNCLASS och ett ABC-prov (prov E) från UNCLASS till NEG vid makrodissektion är dock biologiskt lämpliga eftersom dubbla träfftranslokationer som involverar BCL2 rapporteras vara ett uteslutande GCB-fenomen19. Även om translokationer traditionellt och allestädes närvarande detekteras av FISH i kliniska miljöer, finns det en växande drivkraft för att identifiera en alternativ mindre involverad och tidskrävande metod för deras detektion. DLBCL90-analysen är ett viktigt verktyg som tillgodoser detta behov, där motiveringen för dess användning stärks av upptäckten att denna analys kan detektera translokationer kryptiska till FISH-sonder som används i klinisk diagnostik29.
Makrodissektionsprotokollet som beskrivs ovan beskriver en enkel metod som gör det möjligt för forskare att öka tumörinnehållet i vävnadsprover som vanligtvis skulle falla under vanliga tröskelvärden för studieinkluderingskriterier. Att inkludera makrodissektion i ett studiearbetsflöde gör det möjligt för forskare att rädda dåligt tumörtäta vävnader från studieuteslutning genom att öka deras tumörinnehåll. I sin tur möjliggör detta ökat förtroende för att de resulterande RNA- och DNA-eluaterna representerar tumören under genomisk undersökning. Även om det finns andra mer exakta metoder för vävnadsdissektion, för tumörer som växer på ett mer expansivt, icke-infiltrativt, arkliknande eller fast sätt, är makrodissektion sannolikt tillräcklig. Resultaten som presenteras här belyser vikten av tumörrenhet i genomiska analyser och makrodissektion som ett tillförlitligt verktyg för att uppnå detta.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH-finansierad AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) under dess biospecimen science program. Videon filmades och redigering efter produktion utfördes av Mayo Clinic Media Services.
200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
Coplin pots | Various | x | |
DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
Forceps | Various | x | |
Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
Glycerol | VWR | 0854-1L | |
Master kits | NanoString | various | |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Microtubes | Ambion | AM12400 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |