प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों के लिए नवजात माउस से माइक्रोग्लियल कोशिकाओं का चुंबकीय अलगाव
Summary
प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृतियों का उपयोग आमतौर पर नए विरोधी भड़काऊ अणुओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया को चुंबकीय रूप से अलग करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क निवासी मैक्रोफेज के रूप में, पर्यावरणीय तनाव और मस्तिष्क होमियोस्टेसिस की प्रतिक्रिया सहित कई कार्यों के लिए मौलिक हैं। माइक्रोग्लिया सक्रियण फेनोटाइप के एक बड़े स्पेक्ट्रम को अपना सकता है। इसके अलावा, माइक्रोग्लिया जो प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप का समर्थन करता है, न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों दोनों से जुड़ा हुआ है। विशिष्ट सेल प्रकारों में संभावित चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए अनुसंधान में इन विट्रो अध्ययनों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस संदर्भ में प्राथमिक माइक्रोग्लियल संस्कृतियों का उपयोग करके विट्रो में माइक्रोग्लियल सक्रियण और न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन करना माइक्रोग्लियल सेल लाइनों या स्टेम-सेल-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया की तुलना में अधिक प्रासंगिक है। हालांकि, कुछ प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग प्रजनन क्षमता की कमी से पीड़ित हो सकता है। यह प्रोटोकॉल नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया को चुंबकीय रूप से अलग करने की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक विधि का प्रस्ताव करता है। एमआरएनए अभिव्यक्ति परिमाणीकरण और एक Cy3-मोती फागोसाइटिक परख द्वारा 4 घंटे और 24 घंटे के बाद कई उत्तेजनाओं का उपयोग करके माइक्रोग्लियल सक्रियण यहां प्रदर्शित किया गया है। वर्तमान कार्य से किशोर विकास चरणों से शारीरिक रूप से प्रासंगिक माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक प्रदान करने की उम्मीद है।
Introduction
माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी मैक्रोफेज जैसी कोशिकाएं हैं जो जर्दी थैली के एरिथ्रोपोइटिक अग्रदूतों से प्राप्त होती हैं जो प्रारंभिकभ्रूण के विकास के दौरान न्यूरोएपिथेलियम में स्थानांतरित होती हैं। उनके प्रतिरक्षा कार्यों के अलावा, वे न्यूरोडेवलपमेंट के दौरान भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से सिनैप्टोजेनेसिस, न्यूरोनल होमियोस्टेसिस और माइलिनेशन2 के लिए। वयस्कता में, माइक्रोग्लिया पर्यावरण को लगातार स्कैन करने के लिए लंबी सेलुलर प्रक्रियाओं को विकसित करता है। मस्तिष्क की चोट या मस्तिष्क रोग जैसे होमियोस्टैसिस टूटने के मामले में, माइक्रोग्लिया एक अमीबॉइड आकार को अपनाने के लिए अपनी रूपात्मक उपस्थिति को बदल सकता है, घायल क्षेत्र में पलायन कर सकता है, कई साइटोप्रोटेक्टिव या साइटोटोक्सिक कारकों को बढ़ा सकता है और छोड़ सकता है। माइक्रोग्लिया में उनके विकास चरण और चोट के प्रकार के आधार पर विषम सक्रियण अवस्थाएं होती हैं। इस अध्ययन में, इन सक्रियण राज्यों को मोटे तौर पर तीन अलग-अलग फेनोटाइप्स में वर्गीकृत किया जाता है: प्रो-इंफ्लेमेटरी / फागोसाइटिक, एंटी-इंफ्लेमेटरी और इम्यूनो-रेगुलेटरी, यह ध्यान में रखते हुए कि वास्तव में, स्थितिअधिक जटिल होने की संभावना है।
मस्तिष्क के विकास के शुरुआती चरणों में न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों के लिए विवो माइक्रोग्लियल सक्रियण और स्क्रीनिंग में अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है (1) खरपतवार से पहले जानवरों की नाजुकता और (2) माइक्रोग्लियल कोशिकाओं की कम संख्या। इसलिए माइक्रोग्लिया पर इन विट्रो अध्ययन व्यापक रूप से विषाक्तता 7,8,9, न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों 5,10,11,12,13,14, और सह-संस्कृतियों 15,16,17,18,19,20,21 के लिए उपयोग किए जाते हैं . इन विट्रो अध्ययन या तो माइक्रोग्लियल सेल लाइनों, स्टेम-सेल-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया, या प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृति का उपयोग कर सकते हैं। इन सभी दृष्टिकोणों के फायदे और नुकसान हैं, और विकल्प प्रारंभिक जैविक प्रश्न पर निर्भर करता है। प्राथमिक माइक्रोग्लिया संस्कृतियों का उपयोग करने के लाभ समरूप आनुवंशिक पृष्ठभूमि, रोगज़नक़-मुक्त इतिहास और उस समय का नियंत्रण है जब माइक्रोग्लिया जानवरों की मृत्यु के बाद उत्तेजित होताहै।
वर्षों से, नवजात शिशुओं और वयस्क 23,24,25,26,27,28,29 दोनों से प्राथमिक माइक्रोग्लिया की खेती के लिए विभिन्न तरीकों (फ्लो साइटोमेट्री, शेकिंग, या चुंबकीय लेबलिंग) को विकसित किया गया था। वर्तमान काम में, माउस नवजात पिल्ले से माइक्रोग्लिया अलगाव पहले वर्णित चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग तकनीक का उपयोग करके माइक्रोबीड-लेपित एंटी-माउस सीडी 11 बी 25,27,29 का उपयोग करके किया जाता है। सीडी 11 बी एक इंटीग्रिन-रिसेप्टर है जो माइक्रोग्लिया सहित माइलॉयड कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किया जाता है। जब मस्तिष्क के भीतर कोई भड़काऊ चुनौती नहीं होती है, तो लगभग सभी सीडी 11 बी + कोशिकाएं माइक्रोग्लिया30 होती हैं। अन्य पहले प्रकाशित विधियों 23,24,25,26,27,28,29 की तुलना में, वर्तमान प्रोटोकॉल तत्काल पूर्व विवो माइक्रोग्लियल सक्रियण विश्लेषण और आम इन विट्रो प्राथमिक माइक्रोग्लियल संस्कृति को संतुलित करता है। इस प्रकार, माइक्रोग्लिया (1) प्रसवोत्तर दिन (पी) 8 में माइलिन हटाने के बिना अलग होते हैं, (2) सीरम के बिना सुसंस्कृत होते हैं, और (3) मस्तिष्क अलगाव के केवल 48 घंटे बाद सीआरएनए, एमआईआरएनए, फार्माकोलॉजिकल यौगिक और / या भड़काऊ उत्तेजनाओं के संपर्क में आते हैं। इन तीन पहलुओं में से प्रत्येक वर्तमान प्रोटोकॉल को प्रासंगिक और तेज बनाता है। सबसे पहले, बाल चिकित्सा माइक्रोग्लिया का उपयोग एक अतिरिक्त डिमाइलिनेशन चरण की आवश्यकता के बिना संस्कृति में गतिशील और प्रतिक्रियाशील व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने की अनुमति देता है जो संभावित रूप से विट्रो में माइक्रोग्लियल प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य माइक्रोग्लिया के शारीरिक वातावरण के जितना संभव हो उतना करीब आना है। दरअसल, माइक्रोग्लिया कभी भी सीरम का सामना नहीं करता है, और इस प्रोटोकॉल को सीरम के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, संस्कृति के बाद 48 घंटे की शुरुआत में माइक्रोग्लिया को उजागर करने से उन्हें अपने शारीरिक संकायों को खोने से रोका जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान कार्य चुंबकीय रूप से क्रमबद्ध सीडी 11 बी + कोशिकाओं का उपयोग करके एक प्राथमिक माइक्रोग्लियल सेल संस्कृति प्रस्तुत करता है। माइक्रोग्लियल कार्यात्मक मूल्यांकन (आरटी-क्यूपीसीआर और फागोसाइटिक ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
आंकड़े बायोरेंडर का उपयोग करके बनाए गए थे। अनुसंधान को इंसरम, यूनिवर्सिटी डी पेरिस, होराइजन 2020 (प्रेमस्टेम -874721), फोंडेशन डी फ्रांस, फोंडेशन एआरएसईपी, फोंडेशन पोर ला रेचेरचे सुर ले सेरव्यू, फोंडेशन ग्रेस डी मोनाको द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और निवेश डी’एवेनिर-एएनआर-11-आईएनबीएस-0011-न्यूराट्रिस और इनवेस्टिसमेंट डी’एवेनिर-एएनआर-17-ईयूईआर-001-EUR से अतिरिक्त अनुदान दिया जाता है।
Materials
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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