Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios
Summary
Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.
Abstract
La microglía, como macrófagos residentes en el cerebro, es fundamental para varias funciones, incluida la respuesta al estrés ambiental y la homeostasis cerebral. La microglía puede adoptar un amplio espectro de fenotipos de activación. Además, la microglía que respalda el fenotipo proinflamatorio se asocia con trastornos del desarrollo neurológico y neurodegenerativos. Los estudios in vitro son ampliamente utilizados en la investigación para evaluar posibles estrategias terapéuticas en tipos específicos de células. En este contexto, el estudio de la activación microglial y la neuroinflamación in vitro utilizando cultivos microgliales primarios es más relevante que las líneas celulares microgliales o la microglía derivada de células madre. Sin embargo, el uso de algunos cultivos primarios puede adolecer de una falta de reproducibilidad. Este protocolo propone un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos. Aquí se demuestra la activación microglial utilizando varios estímulos después de 4 h y 24 h mediante la cuantificación de la expresión de ARNm y un ensayo fagocítico de perlas Cy3. Se espera que el trabajo actual proporcione una técnica fácilmente reproducible para aislar microglía fisiológicamente relevante de las etapas de desarrollo juvenil.
Introduction
Las microglías son las células similares a los macrófagos residentes en el sistema nervioso central derivadas de precursores eritropoyéticos del saco vitelino que migran al neuroepitelio durante el desarrollo embrionario temprano1. Además de sus funciones de inmunidad, también juegan un papel importante durante el neurodesarrollo, particularmente para la sinaptogénesis, la homeostasis neuronal y la mielinización2. En la edad adulta, la microglía desarrolla largos procesos celulares para escanear el medio ambiente continuamente. En caso de rupturas de homeostasis como lesión cerebral o enfermedad cerebral, la microglía puede cambiar su apariencia morfológica para adoptar una forma ameboide, migrar a la zona lesionada, aumentar y liberar muchos factores citoprotectores o citotóxicos. Las microglías tienen estados de activación heterogéneos dependiendo de su etapa de desarrollo y del tipo de lesión sufrida 3,4,5. En este estudio, estos estados de activación se clasifican ampliamente en tres fenotipos diferentes: proinflamatorio/fagocítico, antiinflamatorio e inmunorregulador, teniendo en cuenta que, en realidad, la situación es probable que sea más compleja6.
El estudio de la activación microglial in vivo y la detección de estrategias neuroprotectoras en las primeras etapas del desarrollo cerebral puede ser un desafío debido a (1) la fragilidad de los animales antes del destete y (2) el bajo número de células microgliales. Por lo tanto, los estudios in vitro sobre la microglía son ampliamente utilizados para la toxicidad 7,8,9, las estrategias neuroprotectoras5,10,11,12,13,14 y los cocultivos 15,16,17,18,19,20,21 . Los estudios in vitro pueden utilizar líneas celulares microgliales, microglía derivada de células madre o cultivo primario de microglia. Todos estos enfoques tienen ventajas y desventajas, y la elección depende de la pregunta biológica inicial. Los beneficios del uso de cultivos primarios de microglia son los antecedentes genéticos homogéneos, la historia libre de patógenos y el control del momento en que la microglía es estimulada después de la muerte animal22.
A lo largo de los años, se desarrollaron diferentes métodos (citometría de flujo, agitación o marcado magnético) para cultivar microglia primaria de roedores, tanto neonatos como adultos 23,24,25,26,27,28,29. En el presente trabajo, el aislamiento de microglia de crías neonatales de ratón se realiza utilizando la tecnología de clasificación celular activada magnéticamente previamente descrita utilizando CD11b de ratón anti-ratón recubierto de microperlas25,27,29. CD11b es un receptor de integrina expresado en la superficie de las células mieloides, incluida la microglía. Cuando no hay un desafío inflamatorio dentro del cerebro, casi todas las células CD11b + son microglia30. En comparación con otros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, el presente protocolo equilibra los análisis de activación microglial ex vivo inmediato y el cultivo microglial primario in vitro común. Por lo tanto, las microglías son (1) aisladas en el día postnatal (P)8 sin eliminación de mielina, (2) cultivadas sin suero, y (3) expuestas a siRNA, miRNA, compuesto farmacológico y/o estímulos inflamatorios solo 48 h después del aislamiento cerebral. Cada uno de estos tres aspectos hace que el protocolo actual sea relevante y rápido. En primer lugar, el uso de la microglía pediátrica permite obtener células viables dinámicas y reactivas en cultivo sin requerir un paso adicional de desmielinización que podría modificar potencialmente la reactividad microglial in vitro. El presente protocolo tiene como objetivo acercarse lo más posible al entorno fisiológico de la microglía. De hecho, la microglía nunca encuentra suero, y este protocolo tampoco requiere el uso de suero. Además, la exposición de la microglía tan pronto como 48 h después del cultivo evita que pierdan sus facultades fisiológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El trabajo actual presenta un cultivo primario de células microgliales utilizando células CD11b + clasificadas magnéticamente. Además de la evaluación funcional microglial (RT-qPCR y ensayos fagocíticos), también se determinó la pureza del cultivo microglial.
Los cultivos clásicos de células microgliales se generan comúnmente a partir del cerebro neonatal de roedores P1 o P2 y el cocultivo con astrocitos durante al menos 10 días. Las microglías se separan mecánicamente usando un …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Las figuras fueron creadas usando BioRender. La investigación está financiada por Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, y una subvención adicional de Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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