Primära mikrogliakulturer används ofta för att utvärdera nya antiinflammatoriska molekyler. Detta protokoll beskriver en reproducerbar och relevant metod för att magnetiskt isolera mikroglia från nyfödda ungar.
Microglia, som hjärnboende makrofager, är grundläggande för flera funktioner, inklusive svar på miljöstress och hjärnhomeostas. Microglia kan anta ett stort spektrum av aktiveringsfenotyper. Dessutom är microglia som stöder proinflammatorisk fenotyp associerad med både neurodevelopmental och neurodegenerativa störningar. In vitro- studier används ofta i forskning för att utvärdera potentiella terapeutiska strategier i specifika celltyper. I detta sammanhang är det mer relevant att studera mikroglial aktivering och neuroinflammation in vitro med hjälp av primära mikroglialkulturer än mikrogliala cellinjer eller stamcellsbaserade mikroglia. Användningen av vissa primära kulturer kan dock drabbas av brist på reproducerbarhet. Detta protokoll föreslår en reproducerbar och relevant metod för att magnetiskt isolera mikroglia från nyfödda valpar. Mikroglial aktivering med användning av flera stimuli efter 4 h och 24 h genom mRNA-uttryckskvantifiering och en Cy3-pärlfagocytisk analys demonstreras här. Det aktuella arbetet förväntas ge en lätt reproducerbar teknik för att isolera fysiologiskt relevant mikroglia från juvenila utvecklingsstadier.
Microglia är de makrofagliknande cellerna i centrala nervsystemet som härrör från erytropoietiska föregångare till äggula som migrerar till neuroepitelet under tidig embryonal utveckling1. Förutom deras immunitetsfunktioner spelar de också en viktig roll under neuroutveckling, särskilt för synaptogenes, neuronal homeostas och myelinering2. I vuxen ålder utvecklar microglia långa cellulära processer för att skanna miljön kontinuerligt. Vid homeostasbrott som hjärnskada eller hjärnsjukdom kan microglia ändra sitt morfologiska utseende för att anta en amoeboidform, migrera till det skadade området, öka och frigöra många cytoprotektiva eller cytotoxiska faktorer. Microglia har heterogena aktiveringstillstånd beroende på deras utvecklingsstadium och vilken typ av skada som uppstått 3,4,5. I denna studie klassificeras dessa aktiveringstillstånd i stort sett i tre olika fenotyper: proinflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk och immunreglerande, med tanke på att situationen i verkligheten sannolikt kommer att vara mer komplex6.
Att studera mikrogliaaktivering in vivo och screening för neuroprotektiva strategier i tidiga stadier av hjärnans utveckling kan vara utmanande på grund av (1) djurens bräcklighet före avvänjning och (2) det låga antalet mikrogliaceller. Därför används in vitro-studier på mikroglia i stor utsträckning för toxicitet 7,8,9, neuroprotektiva strategier5,10,11,12,13,14 och samkulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-studier kan använda antingen mikrogliala cellinjer, stamcellsderiverade mikroglia eller primär mikrogliakultur. Alla dessa tillvägagångssätt har fördelar och nackdelar, och valet beror på den ursprungliga biologiska frågan. Fördelarna med att använda primära mikrogliakulturer är den homogena genetiska bakgrunden, patogenfri historia och kontroll av den tid då mikroglia stimuleras efter djurdöd22.
Under åren utvecklades olika metoder (flödescytometri, skakning eller magnetisk märkning) för odling av primär mikroglia från gnagare, både nyfödda och vuxna 23,24,25,26,27,28,29. I detta arbete utförs mikrogliaisolering från musnyfödda ungar med hjälp av tidigare beskriven magnetaktiverad cellsorteringsteknik med hjälp av mikropärlbelagd antimus-CD11b25,27,29. CD11b är en integrinreceptor uttryckt vid ytan av myeloida celler, inklusive mikroglia. När det inte finns någon inflammatorisk utmaning i hjärnan är nästan alla CD11b + -celler microglia30. Jämfört med andra tidigare publicerade metoder 23,24,25,26,27,28,29, balanserar detta protokoll omedelbara ex vivo mikroglialaktiveringsanalyser och vanlig in vitro primär mikroglialkultur. Således isoleras mikroglia (1) efter födseln (P) 8 utan myelinavlägsnande, (2) odlas utan serum och (3) exponeras antingen för siRNA, miRNA, farmakologisk förening och / eller inflammatoriska stimuli endast 48 timmar efter hjärnisolering. Var och en av dessa tre aspekter gör det nuvarande protokollet relevant och snabbt. Först och främst möjliggör användningen av pediatrisk mikroglia att erhålla dynamiska och reaktiva livskraftiga celler i odling utan att kräva ett ytterligare demyelineringssteg som potentiellt kan modifiera mikroglial reaktivitet in vitro. Detta protokoll syftar till att komma så nära den fysiologiska miljön i microglia som möjligt. Faktum är att microglia aldrig stöter på serum, och detta protokoll kräver inte heller användning av serum. Dessutom hindrar exponering av mikroglia så tidigt som 48 timmar efter odling dem från att förlora sina fysiologiska förmågor.
Det aktuella arbetet presenterar en primär mikroglialcellodling med magnetiskt sorterade CD11b + -celler. Förutom den mikrogliala funktionella utvärderingen (RT-qPCR och fagocytiska analyser) bestämdes också mikroglialodlingsrenhet.
Klassiska mikrogliacellkulturer genereras vanligtvis från P1- eller P2-gnagare nyfödda hjärna och samodling med astrocyter i minst 10 dagar. Microglia separeras sedan mekaniskt med hjälp av en orbital shaker. Metoden att isolera och odla microglia in v…
The authors have nothing to disclose.
Figurer skapades med BioRender. Forskningen finansieras av Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco och ett ytterligare bidrag från Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS och Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |