Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Probenvorbereitungsmethode, die auf Wärmeinaktivierung basiert, um endogene Peptide zu erhalten und den Abbau post mortem zu vermeiden, gefolgt von einer relativen Quantifizierung mittels Isotopenmarkierung plus LC-MS.
Abstract
Peptidomics kann als die qualitative und quantitative Analyse von Peptiden in einer biologischen Probe definiert werden. Zu den Hauptanwendungen gehören die Identifizierung der Peptid-Biomarker für Krankheit oder Umweltstress, die Identifizierung von Neuropeptiden, Hormonen und bioaktiven intrazellulären Peptiden, die Entdeckung antimikrobieller und nutrazeutischer Peptide aus Proteinhydrolysaten und können in Studien verwendet werden, um die proteolytischen Prozesse zu verstehen. Der jüngste Fortschritt in der Probenvorbereitung, Trennmethoden, Massenspektrometrietechniken und Berechnungswerkzeugen im Zusammenhang mit der Proteinsequenzierung hat zur Erhöhung der identifizierten Peptidzahl und der charakterisierten Peptidome beigetragen. Peptidomische Studien analysieren häufig Peptide, die auf natürliche Weise in Zellen erzeugt werden. Hier wird ein Probenvorbereitungsprotokoll beschrieben, das auf Wärmeinaktivierung basiert, das die Proteaseaktivität eliminiert, und die Extraktion unter milden Bedingungen, so dass es keine Spaltung der Peptidbindungen gibt. Darüber hinaus wird auch die relative Quantifizierung von Peptiden mittels stabiler Isotopenmarkierung durch reduktive Methylierung von Aminen gezeigt. Diese Markierungsmethode hat einige Vorteile, da die Reagenzien im Handel erhältlich, im Vergleich zu anderen kostengünstig, chemisch stabil sind und die Analyse von bis zu fünf Proben in einem einzigen LC-MS-Lauf ermöglichen.
Introduction
“Omics” -Wissenschaften zeichnen sich durch die tiefe Analyse eines Molekülsatzes wie DNA, RNA, Proteine, Peptide, Metaboliten usw. aus. Diese generierten groß angelegten Datensätze (Genomik, Transkriptomik, Proteomik, Peptidomik, Metabolomik usw.) haben die Biologie revolutioniert und zu einem fortgeschrittenen Verständnis biologischer Prozesse geführt1. Der Begriff Peptidomik wurde im frühen 20. Jahrhundert eingeführt, und einige Autoren haben ihn als einen Zweig der Proteomik bezeichnet2. Die Peptidomik weist jedoch deutliche Besonderheiten auf, wobei das Hauptinteresse darin besteht, den natürlich erzeugten Peptidgehalt während zellulärer Prozesse sowie die Charakterisierung der biologischen Aktivität dieser Moleküle zu untersuchen3,4.
Zunächst beschränkten sich bioaktive Peptidstudien auf die Neuropeptide und Hormonpeptide durch Edman-Abbau und Radioimmunoassay. Diese Techniken erlauben jedoch keine globale Analyse, abhängig von der Isolierung jedes Peptids in hohen Konzentrationen, Zeit für die Bildung von Antikörpern, neben der Kreuzreaktivitätsmöglichkeit5.
Die Peptidomik-Analyse wurde erst nach mehreren Fortschritten in der Flüssigkeitschromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie (LC-MS) und Genomprojekten ermöglicht, die umfassende Datenpools für Proteomik-/Peptidomik-Studien lieferten6,7. Darüber hinaus musste ein spezifisches Peptidextraktionsprotokoll für Peptidome etabliert werden, da die ersten Studien, die Neuropeptide weltweit in Gehirnproben analysierten, zeigten, dass der Nachweis durch den massiven Abbau von Proteinen beeinflusst wurde, die hauptsächlich in diesem Gewebe nach 1 min Post mortem auftreten. Das Vorhandensein dieser Peptidfragmente maskierte das Neuropeptidsignal und stellte das Peptidom in vivo nicht dar. Dieses Problem wurde hauptsächlich durch die Anwendung der schnellen Erwärmungsinaktivierung von Proteasen mittels Mikrowellenbestrahlung gelöst, die das Vorhandensein dieser Artefaktfragmente drastisch reduzierte und nicht nur die Identifizierung von Neuropeptidfragmenten ermöglichte, sondern auch das Vorhandensein einer Reihe von Peptiden aus zytosolischen, mitochondrialen und Kernproteinen aufdeckte, die sich von Degradome unterscheiden6,8,9.
Diese methodischen Verfahren ermöglichten eine Erweiterung des Peptidoms über die bekannten Neuropeptide hinaus, wo Hunderte von intrazellulären Peptiden, die hauptsächlich durch die Wirkung von Proteasomen erzeugt wurden, in Hefe10, Zebrafischen11, Nagetiergeweben12 und menschlichen Zellen13 identifiziert wurden. Dutzende dieser intrazellulären Peptide haben nachweislich sowohl biologische als auch pharmakologische Aktivitäten14,15. Darüber hinaus können diese Peptide als Krankheitsbiomarker verwendet werden und haben möglicherweise klinische Bedeutung, wie in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit intrakraniellen sackförmigen Aneurysmen gezeigt wurde16.
Derzeit ist es neben der Identifizierung von Peptidsequenzen durch Massenspektrometrie möglich, Daten der absoluten und relativen Quantifizierung zu erhalten. Bei der absoluten Quantifizierung werden die Peptidspiegel in einer biologischen Probe mit synthetischen Standards verglichen, während bei der relativen Quantifizierung die Peptidspiegel zwischen zwei oder mehr Proben verglichen werden17. Die relative Quantifizierung kann mit den folgenden Ansätzen durchgeführt werden: 1) “label free”18; 2) in vivo metabolische Markierung oder 3) chemische Markierung. Die letzten beiden basieren auf der Verwendung stabiler Isotopenformen, die in Peptide eingebaut sind19,20. Bei der markierungsfreien Analyse werden die Peptidspiegel unter Berücksichtigung der Signalstärke (Spektralzählungen) während des LC-MS18 geschätzt. Die Isotopenmarkierung kann jedoch genauere relative Konzentrationen von Peptiden erhalten.
Viele peptidomische Studien verwendeten Trimethylammoniumbutyrat (TMAB) Markierungsreagenzien als chemische Markierung, und in jüngerer Zeit wurde die reduktive Methylierung von Aminen (RMA) mit deuterierten und nicht deuterierten Formen von Formaldehyd und Natriumcyanoborhydridreagenzien verwendet11,21,22. Die TMAB-Etiketten sind jedoch nicht im Handel erhältlich und der Syntheseprozess ist sehr aufwendig. Auf der anderen Seite sind die Reagenzien in der RMA kommerziell erhältlich, kostengünstig im Vergleich zu anderen Etiketten, das Verfahren ist einfach durchzuführen und die markierten Peptide sind stabil23,24.
Die Verwendung von RMA beinhaltet die Bildung einer Schiff-Base, indem die Peptide mit Formaldehyd reagieren können, gefolgt von einer Reduktionsreaktion durch das Cyanoborhydrid. Diese Reaktion bewirkt eine Dimethylierung freier Aminogruppen auf N-terminalen und Lysin-Seitenketten und Monomethylaten N-terminalen Prolinen. Da Prolinreste auf dem N-Terminal oft selten sind, sind praktisch alle Peptide mit freien Aminen am N-Terminus mit zwei Methylgruppen markiert23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den meisten Peptidomik-Studien ist einer der kritischen Schritte zweifellos die Probenvorbereitung, die sorgfältig durchgeführt werden sollte, um das Vorhandensein von Peptidfragmenten zu vermeiden, die von Proteasen nach einigen Minuten post mortem erzeugt werden. Die ersten Studien an Gehirnextrakten, die aus nicht in der Mikrowelle hergestellten Proben hergestellt wurden, zeigten eine große Anzahl von Proteinfragmenten, die in den 10-kDa-Mikrofiltraten vorhanden sind. Es wurden verschiedene Ansätze beschrieben<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Entwicklung und Anwendung der hier beschriebenen Techniken wurde durch den zuschuss des brasilianischen Nationalen Forschungsrats 420811/2018-4 (LMC) unterstützt; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) Zuschüsse 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) und 21/01286-1 (MEME). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Artikels.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
