הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית
Summary
מאמר זה מתאר שיטת הכנה לדוגמה המבוססת על אי-פעולת חום כדי לשמר פפטידים אנדוגני הימנעות השפלה לאחר המוות, ואחריו כמות יחסית באמצעות תיוג איזוטופי בתוספת LC-MS.
Abstract
פפטידומיקה יכולה להיות מוגדרת כניתוח איכותי וכמותי של פפטידים במדגם ביולוגי. היישומים העיקריים שלה כוללים זיהוי סמנים ביולוגיים פפטיד של מחלות או מתח סביבתי, זיהוי נוירופפטידים, הורמונים, פפטידים תאיים ביואקטיביים, גילוי פפטידים מיקרוביאליים ו nutraceutical מחלבון הידרוליזטים, וניתן להשתמש בהם במחקרים כדי להבין את התהליכים הפרוטאוליטיים. ההתקדמות האחרונה בהכנת מדגם, שיטות הפרדה, טכניקות ספקטרומטריית מסה וכלים חישוביים הקשורים לרצף חלבונים תרמה לעלייה במספר הפפטידים והפפטידום המזוהים המאופיינים. מחקרים פפטידום לעתים קרובות לנתח פפטידים שנוצרים באופן טבעי בתאים. כאן, פרוטוקול הכנה מדגם המבוסס על אי-פעילות חום מתואר, אשר מבטל פעילות פרוטאז, ומיצוי עם תנאים קלים, כך שאין מחשוף קשרים פפטיד. בנוסף, כמות יחסית של פפטידים באמצעות תיוג איזוטופ יציב על ידי מתילציה מופחתת של אמינים מוצג גם. שיטת תיוג זו יש כמה יתרונות כמו ריאגנטים זמינים מסחרית, זול בהשוואה לאחרים, יציב מבחינה כימית, ומאפשר ניתוח של עד חמש דגימות בריצה אחת LC-MS.
Introduction
מדעי “Omics” מאופיינים בניתוח עמוק של ערכת מולקולות, כגון DNA, RNA, חלבונים, פפטידים, מטבוליטים וכו ‘. ערכות נתונים בקנה מידה גדול אלה (גנומיקה, תמלול, פרוטאומיה, פפטידומיקה, מטבולומיה וכו ‘) חוללו מהפכה בביולוגיה והובילו להבנה מתקדמת של תהליכים ביולוגיים1. המונח פפטידומיקה החל להיות מוצג בתחילת המאה ה –20, וכמה מחברים התייחסו אליו כענף של פרוטאומיקס2. עם זאת, לפפטידוזיקה יש פרטים ברורים, כאשר האינטרס העיקרי הוא לחקור את תוכן הפפטידים שנוצר באופן טבעי במהלך תהליכים תאיים, כמו גם את אפיון הפעילות הביולוגית של מולקולות אלה3,4.
בתחילה, מחקרי פפטיד ביואקטיביים הוגבלו נוירופפטידים ופפטידים הורמונליים באמצעות השפלה אדמן ורדיוימונואסאי. עם זאת, טכניקות אלה אינן מאפשרות ניתוח גלובלי, בהתאם לבידוד של כל פפטיד בריכוזים גבוהים, זמן ליצירת נוגדנים, מלבד אפשרות תגובה צולבת5.
ניתוח פפטידומיקה התאפשר רק לאחר מספר התקדמות בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה (LC-MS) ופרויקטים של גנום שסיפקו מאגרי נתונים מקיפים למחקרי פרוטאומיקה/פפטידומיקה6,7. יתר על כן, פרוטוקול מיצוי פפטיד ספציפי עבור peptidomes היה צריך להיות הוקם כי המחקרים הראשונים שניתחו neuropeptides ברחבי העולם בדגימות המוח הראו כי זיהוי הושפע השפלה מסיבית של חלבונים, אשר מתרחשים בעיקר ברקמה זו לאחר 1 דקות לאחר המוות. נוכחותם של שברי פפטיד אלה הסתירו את אות הנוירופפטיד ולא ייצגו את הפפטידום ב- vivo. בעיה זו נפתרה בעיקר עם היישום של חימום מהיר של פעילות פרוטאזים באמצעות הקרנת מיקרוגל, אשר הפחית באופן דרסטי את נוכחותם של שברי חפץ אלה ואפשר לא רק זיהוי של שברי נוירופפטיד, אלא חשף את נוכחותם של קבוצה של פפטידים מחלבונים ציטוזוליים, מיטוכונדריאליים וגרעין, שונים של degradome6,8,9.
הליכים מתודולוגיים אלה אפשרו הרחבה של הפפטידום מעבר לנוירופפטידים הידועים, שם זוהו מאות פפטידים תאיים שנוצרו בעיקר על ידי פעולת הפרוטאוזומים בשמרים10, זברה11, רקמות מכרסמים12 ותאים אנושיים13. עשרות פפטידים תאיים אלה הוכחו בהרחבה כבעלי פעילויות ביולוגיות ופרמקולוגיות כאחד14,15. יתר על כן, פפטידים אלה יכולים לשמש סמנים ביולוגיים של מחלות ואולי יש משמעות קלינית, כפי שהוכח בנוזל השדרתי מחולים עם מפרצת תוך גולגולתית16.
נכון לעכשיו, בנוסף לזיהוי רצפי פפטיד, ניתן באמצעות ספקטרומטריית מסה להשיג נתונים של כמות מוחלטת ויחסית. בכמות המוחלטת, רמות הפפטיד במדגם ביולוגי מושוות לתקנים סינתטיים, ואילו בכמות היחסית, רמות הפפטיד משווות בין שתי דגימות או יותר17. כמות יחסית יכולה להתבצע באמצעות הגישות הבאות: 1) “תווית חינם”18; 2) בסימון מטבולי vivo או 3) תיוג כימי. שני האחרונים מבוססים על שימוש בצורות איזוטופיות יציבות המשולבות בפפטידים19,20. בניתוח ללא תוויות, רמות הפפטיד מוערכות על ידי התחשבות בעוצמת האות (ספירות ספקטרליות) במהלך LC-MS18. עם זאת, תיוג איזוטופי יכול להשיג רמות יחסיות מדויקות יותר של פפטידים.
מחקרים פפטידום רבים השתמשו טרימתילאמוניום butyrate (TMAB) תיוג ריאגנטים כמו תיוג כימי, ולאחרונה, מתילציה רדוקטיבית של אמינים (RMA) עם צורות deuteed ולא deuteed של פורמלדהיד ונתרן cyanoborohydride ריאגנטים שימשו11,21,222. עם זאת, תוויות TMAB אינן זמינות מסחרית, ותהליך הסינתזה הוא מייגע מאוד. מצד שני, ב RMA, ריאגנטים זמינים מסחרית, זול בהשוואה תוויות אחרות, ההליך הוא פשוט לביצוע, ואת פפטידים מסומנים יציבים23,24.
השימוש ב- RMA כרוך בהקמת בסיס שיף על ידי מתן אפשרות לפפטידים להגיב עם פורמלדהיד, ואחריו תגובת הפחתה באמצעות ציאנובורוהידריד. תגובה זו גורמת דימתילציה של קבוצות אמינו חינם על N-מסופים ושרשראות צד ליצין ו monomethylates N-מסוף prolines. איך שאריות פרולין הם לעתים קרובות נדיר על N-מסוף, כמעט כל הפפטידים עם אמינים חינם על N-טרמינל מסומנים עם שתי קבוצות מתיל23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
ברוב המחקרים פפטידום, אחד הצעדים הקריטיים הוא, ללא ספק, הכנת המדגם כי צריך להתבצע בקפידה כדי למנוע נוכחות של שברי פפטיד שנוצר על ידי פרוטאזים לאחר כמה דקות לאחר המוות. המחקרים הראשוניים על תמציות מוח שהוכנו מדגימות שאינן במיקרוגל הראו מספר רב של שברי חלבון להיות נוכחים 10-kDa microfiltrates. גישות ש?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפיתוח והשימוש בטכניקות המתוארות כאן נתמכו על ידי מענק המועצה הלאומית הברזילאית 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) grants 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) ו-21/01286-1 (MEME). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, ההחלטה לפרסם או הכנת המאמר.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
