नमूना तैयारी और सापेक्ष मात्रा Peptidomics अध्ययन के लिए Amines के रिडक्टिव मिथाइलेशन का उपयोग कर
Summary
यह आलेख अंतर्जात पेप्टाइड्स को अवक्रमण पोस्टमार्टम से बचने के लिए संरक्षित करने के लिए गर्मी-निष्क्रियता के आधार पर एक नमूना तैयारी विधि का वर्णन करता है, इसके बाद आइसोटोपिक लेबलिंग प्लस एलसी-एमएस का उपयोग करके सापेक्ष मात्रा होती है।
Abstract
पेप्टिडोमिक्स को जैविक नमूने में पेप्टाइड्स के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। इसके मुख्य अनुप्रयोगों में रोग या पर्यावरणीय तनाव के पेप्टाइड बायोमार्कर की पहचान करना, न्यूरोपेप्टाइड्स, हार्मोन और बायोएक्टिव इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स की पहचान करना, प्रोटीन हाइड्रोलिसेट्स से रोगाणुरोधी और न्यूट्रास्यूटिकल पेप्टाइड्स की खोज करना शामिल है, और प्रोटियोलिटिक प्रक्रियाओं को समझने के लिए अध्ययन में उपयोग किया जा सकता है। नमूना तैयारी, अलगाव विधियों, मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों और प्रोटीन अनुक्रमण से संबंधित कम्प्यूटेशनल उपकरणों में हाल ही में अग्रिम ने पहचाने गए पेप्टाइड्स संख्या और पेप्टिडोम की विशेषता की वृद्धि में योगदान दिया है। पेप्टिडोमिक अध्ययन अक्सर पेप्टाइड्स का विश्लेषण करते हैं जो स्वाभाविक रूप से कोशिकाओं में उत्पन्न होते हैं। यहां, गर्मी-निष्क्रियता के आधार पर एक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो प्रोटीज गतिविधि को समाप्त करता है, और हल्के स्थितियों के साथ निष्कर्षण करता है, इसलिए कोई पेप्टाइड बांड दरार नहीं है। इसके अलावा, एमाइंस के रिडक्टिव मिथाइलेशन द्वारा स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करके पेप्टाइड्स की सापेक्ष मात्रा भी दिखाई गई है। इस लेबलिंग विधि के कुछ फायदे हैं क्योंकि अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, दूसरों की तुलना में सस्ती, रासायनिक रूप से स्थिर हैं, और एकल एलसी-एमएस रन में पांच नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देता है।
Introduction
“ओमिक्स” विज्ञान को एक अणु सेट के गहरे विश्लेषण की विशेषता है, जैसे कि डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, पेप्टाइड्स, मेटाबोलाइट्स, आदि। इन बड़े पैमाने पर डेटासेट (जीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, प्रोटिओमिक्स, पेप्टिडोमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, आदि) ने जीव विज्ञान में क्रांति ला दी है और जैविक प्रक्रियाओं की एक उन्नत समझ का नेतृत्व किया है। पेप्टिडोमिक्स शब्द को 20 वीं शताब्दी की शुरुआत में पेश किया जाने लगा, और कुछ लेखकों ने इसे प्रोटिओमिक्स 2 की एक शाखा के रूप में संदर्भित किया है। हालांकि, पेप्टिडोमिक्स की अलग-अलग विशिष्टताएं हैं, जहां मुख्य रुचि सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान स्वाभाविक रूप से उत्पन्न पेप्टाइड्स सामग्री की जांच करना है, साथ ही साथ इन अणुओं की जैविक गतिविधि के लक्षण वर्णन 3,4।
प्रारंभ में, बायोएक्टिव पेप्टाइड अध्ययन एडमैन गिरावट और रेडियोइम्यूनोसे के माध्यम से न्यूरोपेप्टाइड्स और हार्मोन पेप्टाइड्स तक सीमित थे। हालांकि, ये तकनीकें वैश्विक विश्लेषण की अनुमति नहीं देती हैं, जो उच्च सांद्रता में प्रत्येक पेप्टाइड के अलगाव पर निर्भर करती है, एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए समय, क्रॉस-रिएक्टिविटी संभावना 5 के अलावा।
पेप्टिडोमिक्स विश्लेषण केवल तरल क्रोमैटोग्राफी युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) और जीनोम परियोजनाओं में कई प्रगति के बाद संभव हो गया था, जिसने प्रोटिओमिक्स / पेप्टिडोमिक्स अध्ययन 6,7 के लिए व्यापक डेटा पूल वितरित किए थे। इसके अलावा, पेप्टिडोम के लिए एक विशिष्ट पेप्टाइड निष्कर्षण प्रोटोकॉल स्थापित करने की आवश्यकता थी क्योंकि मस्तिष्क के नमूनों में वैश्विक स्तर पर न्यूरोपेप्टाइड्स का विश्लेषण करने वाले पहले अध्ययनों से पता चला कि पता लगाना प्रोटीन के बड़े पैमाने पर गिरावट से प्रभावित था, जो मुख्य रूप से 1 मिनट के पोस्टमार्टम के बाद इस ऊतक में होता है। इन पेप्टाइड टुकड़ों की उपस्थिति ने न्यूरोपेप्टाइड सिग्नल को नकाबपोश किया और विवो में पेप्टिडोम का प्रतिनिधित्व नहीं किया। इस समस्या को मुख्य रूप से माइक्रोवेव विकिरण का उपयोग करके प्रोटीज के तेजी से हीटिंग निष्क्रियता के आवेदन के साथ हल किया गया था, जिसने इन आर्टिफैक्ट टुकड़ों की उपस्थिति को काफी कम कर दिया और न केवल न्यूरोपेप्टाइड टुकड़ों की पहचान की अनुमति दी, बल्कि साइटोसोलिक, माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु प्रोटीन से पेप्टाइड्स के एक सेट की उपस्थिति का पता चला, जो डिग्रेडोम 6,8,9 से अलग था।
इन methodological प्रक्रियाओं ने प्रसिद्ध न्यूरोपेप्टाइड्स से परे पेप्टिडोम के विस्तार की अनुमति दी, जहां मुख्य रूप से एंटीऑक्सीम की कार्रवाई से उत्पन्न सैकड़ों इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स को खमीर 10, ज़ेब्राफ़िश 11, कृंतक ऊतक12 और मानव कोशिकाओं 13 में पहचाना गया है। इन इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स के दर्जनों को बड़े पैमाने पर जैविक और औषधीय दोनों गतिविधियों के लिए दिखाया गया है14,15। इसके अलावा, इन पेप्टाइड्स का उपयोग रोग बायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है और संभवतः नैदानिक महत्व है, जैसा कि इंट्राक्रैनियल सैकुलर एन्यूरिज्म वाले रोगियों से मस्तिष्कमेरु द्रव में प्रदर्शित किया गया है।
वर्तमान में, पेप्टाइड अनुक्रमों की पहचान के अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पूर्ण और सापेक्ष मात्रा के डेटा प्राप्त करना संभव है। पूर्ण मात्रा में, जैविक नमूने में पेप्टाइड के स्तर की तुलना सिंथेटिक मानकों से की जाती है, जबकि सापेक्ष मात्रा में, पेप्टाइड के स्तर की तुलना दो या अधिक नमूनों के बीच की जाती है17। सापेक्ष मात्रा निम्नलिखित दृष्टिकोणों का उपयोग करके की जा सकती है: 1) “लेबल मुक्त”18; 2) विवो चयापचय लेबलिंग में या 3) रासायनिक लेबलिंग। अंतिम दो पेप्टाइड्स 19,20 में शामिल स्थिर आइसोटोपिक रूपों के उपयोग पर आधारित हैं। लेबल-मुक्त विश्लेषण में, पेप्टाइड के स्तर का अनुमान एलसी-एमएस 18 के दौरान सिग्नल ताकत (वर्णक्रमीय गिनती) पर विचार करके किया जाता है। हालांकि, आइसोटोपिक लेबलिंग पेप्टाइड्स के अधिक सटीक सापेक्ष स्तर प्राप्त कर सकती है।
कई पेप्टिडोमिक अध्ययनों ने रासायनिक लेबलिंग के रूप में ट्राइमिथाइलअमोनियम ब्यूटिरेट (टीएमएबी) लेबलिंग अभिकर्मकों का उपयोग किया, और हाल ही में, फॉर्मेल्डिहाइड और सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड अभिकर्मकों के ड्यूटेरेटेड और गैर-ड्यूटेरेटेड रूपों के साथ एमाइंस (आरएमए) के रिडक्टिव मिथाइलेशन का उपयोग किया गया है11,21,22। हालांकि, टीएमएबी लेबल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, और संश्लेषण प्रक्रिया बहुत श्रमसाध्य है। दूसरी ओर, आरएमए में, अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, अन्य लेबल की तुलना में सस्ती हैं, प्रक्रिया प्रदर्शन करने के लिए सरल है, और लेबल पेप्टाइड्स स्थिर 23,24 हैं।
आरएमए के उपयोग में पेप्टाइड्स को फॉर्मेल्डिहाइड के साथ प्रतिक्रिया करने की अनुमति देकर एक शिफ बेस बनाना शामिल है, इसके बाद साइनोबोरोहाइड्राइड के माध्यम से कमी की प्रतिक्रिया होती है। यह प्रतिक्रिया एन-टर्मिनलों और लाइसिन साइड चेन और मोनोमेथिलेट्स एन-टर्मिनल प्रोलाइन्स पर मुक्त अमीनो समूहों के डाइमिथाइलेशन का कारण बनती है। कैसे प्रोलाइन अवशेष अक्सर एन-टर्मिनल पर दुर्लभ होते हैं, व्यावहारिक रूप से एन-टर्मिनस पर मुफ्त अमीन्स के साथ सभी पेप्टाइड्स को दो मिथाइल समूहों 23,24,25 के साथ लेबल किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अधिकांश पेप्टिडोमिक्स अध्ययनों में, महत्वपूर्ण चरणों में से एक, बिना किसी संदेह के, नमूना तैयारी है जिसे कुछ मिनटों के पोस्टमार्टम के बाद प्रोटीज द्वारा उत्पन्न पेप्टाइड टुकड़ों की उपस्थिति से बचने ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहां वर्णित तकनीकों के विकास और उपयोग को ब्राजील के राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद अनुदान 420811/ 2018-4 (एलएमसी) द्वारा समर्थित किया गया था; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (www.fapesp.br) अनुदान 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) और 21/01286-1 (MEME)। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के निर्णय, या लेख की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
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