Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica
Summary
Este artigo descreve um método de preparação amostral baseado na inativação de calor para preservar peptídeos endógenos evitando a degradação pós-morte, seguido de quantitação relativa usando rotulagem isotópica mais LC-MS.
Abstract
A peptidomia pode ser definida como a análise qualitativa e quantitativa dos peptídeos em uma amostra biológica. Suas principais aplicações incluem identificar os biomarcadores de peptídeos de doença ou estresse ambiental, identificar neuropeptídeos, hormônios e peptídeos intracelulares bioativos, descobrir peptídeos antimicrobianos e nutracêuticos a partir de hidrólises proteicos, e pode ser usado em estudos para entender os processos proteolíticos. O recente avanço na preparação da amostra, métodos de separação, técnicas de espectrometria de massa e ferramentas computacionais relacionadas ao sequenciamento de proteínas contribuíram para o aumento do número de peptídeos identificados e peptidomes caracterizados. Estudos peptidômicos frequentemente analisam peptídeos que são gerados naturalmente nas células. Aqui, é descrito um protocolo de preparação de amostras baseado na inativação do calor, que elimina a atividade de protease, e extração com condições leves, portanto não há laços de peptídeos. Além disso, também é mostrada a quantitação relativa de peptídeos usando rotulagem estável de isótopos por metilação redutiva de aminas. Este método de rotulagem tem algumas vantagens, pois os reagentes estão disponíveis comercialmente, baratos em comparação com outros, quimicamente estáveis, e permite a análise de até cinco amostras em uma única corrida LC-MS.
Introduction
As ciências “omics” são caracterizadas pela análise profunda de um conjunto de moléculas, como DNA, RNA, proteínas, peptídeos, metabólitos, etc. Estes conjuntos de dados gerados em larga escala (genômica, transcriômica, proteômica, peptidômica, metabolômica, etc.) revolucionaram a biologia e levaram a uma compreensão avançada dos processos biológicos1. O termo peptidomia começou a ser introduzido no início do século XX, e alguns autores se referem a ele como um ramo da proteômica2. No entanto, a peptidômica possui particularidades distintas, onde o principal interesse é investigar o conteúdo de peptídeos gerados naturalmente durante os processos celulares, bem como a caracterização da atividade biológica dessas moléculas3,4.
Inicialmente, os estudos de peptídeos bioativos eram restritos aos neuropeptídeos e peptídeos hormonais através da degradação de Edman e radioimunessay. No entanto, essas técnicas não permitem uma análise global, dependendo do isolamento de cada peptídeo em altas concentrações, tempo para a geração de anticorpos, além da possibilidade de reatividade cruzada5.
A análise da peptidomia só foi possível após vários avanços na cromatografia líquida acoplado à espectrometria de massa (LC-MS) e projetos de genoma que forneceram pools de dados abrangentes para estudos proteômicos/peptidóticos6,7. Além disso, um protocolo específico de extração de peptídeos para peptidomes precisava ser estabelecido porque os primeiros estudos que analisaram neuropeptídeos globalmente em amostras cerebrais mostraram que a detecção foi afetada pela degradação maciça de proteínas, que ocorrem principalmente neste tecido após 1 min após a morte. A presença desses fragmentos de peptídeo mascarava o sinal de neuropeptídeo e não representava o peptidome in vivo. Esse problema foi resolvido principalmente com a aplicação de inativação de aquecimento rápido de proteases usando irradiação de micro-ondas, o que reduziu drasticamente a presença desses fragmentos de artefato e permitiu não apenas a identificação de fragmentos de neuropeptídeos, mas revelou a presença de um conjunto de peptídeos de proteínas citostómicas, mitocondriais e nucleares, diferentes de degradação6,8,9.
Esses procedimentos metodológicos permitiram uma expansão do peptidome para além dos conhecidos neuropeptídeos, onde centenas de peptídeos intracelulares gerados principalmente pela ação de proteasomes foram identificados em leveduras10, zebrafish11, tecidos de roedores12 e células humanas13. Dezenas desses peptídeos intracelulares têm sido extensivamente mostrados com atividades biológicas e farmacológicas14,15. Além disso, esses peptídeos podem ser usados como biomarcadores de doenças e possivelmente ter significância clínica, como demonstrado no fluido cefalorraquidiano de pacientes com aneurisma saccular intracraniano16.
Atualmente, além da identificação de sequências de peptídeos, é possível através da espectrometria de massa obter dados de quantitação absoluta e relativa. Na quantitação absoluta, os níveis de peptídeos em uma amostra biológica são comparados aos padrões sintéticos, enquanto na quantitação relativa, os níveis de peptídeos são comparados entre duas ou mais amostras17. A quantitação relativa pode ser realizada utilizando as seguintes abordagens: 1) “livre de rótulos”18; 2) rotulagem metabólica in vivo ou 3) rotulagem química. Os dois últimos baseiam-se no uso de formas isotópicas estáveis incorporadas em peptídeos19,20. Na análise sem rótulos, os níveis de peptídeos são estimados considerando a força do sinal (contagem espectral) durante o LC-MS18. No entanto, a rotulagem isotópica pode obter níveis relativos mais precisos de peptídeos.
Muitos estudos peptidômicos utilizaram butiratrato de trimetilamônio (TMAB) rotulando reagentes como rotulagem química, e mais recentemente, a metilação redutiva de Aminas (RMA) com formas deutadas e não deuteradas de reagentes de formaldeído e cianoboroiddeto de sódio foram usados11,21,22. No entanto, os rótulos TMAB não estão disponíveis comercialmente, e o processo de síntese é muito trabalhoso. Por outro lado, na RMA, os reagentes estão disponíveis comercialmente, baratos em comparação com outros rótulos, o procedimento é simples de realizar, e os peptídeos rotulados são estáveis23,24.
O uso de RMA envolve a formação de uma base de Schiff permitindo que os peptídeos reajam com formaldeído, seguido de uma reação de redução através do cianoboroidido. Esta reação causa dimetilação de grupos de amino livres em terminais N e cadeias laterais de lise e monometilados N-terminais prolines. Como os resíduos de prolina são muitas vezes raros no terminal N, praticamente todos os peptídeos com aminas gratuitas no n-terminus são rotulados com dois grupos de metila23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na maioria dos estudos de peptidóticos, um dos passos críticos é, sem dúvida, a preparação da amostra que deve ser cuidadosamente realizada para evitar a presença de fragmentos de peptídeos gerados por proteases após alguns minutos após a morte. Os estudos iniciais sobre extratos cerebrais preparados a partir de amostras não micro-ondas mostraram um grande número de fragmentos de proteínas presentes nos microfiltratos de 10 kDa. Diferentes abordagens foram descritas para evitar espectros de peptídeos da deg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O desenvolvimento e o uso das técnicas aqui descritas foram apoiados pelo Conselho Nacional de Pesquisa 420811/2018-4 (LMC); A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) concede 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) e 21/01286-1 (MEME). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do artigo.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
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