Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica
Summary
Este artículo describe un método de preparación de muestras basado en la inactivación por calor para preservar los péptidos endógenos evitando la degradación post mortem, seguido de una cuantificación relativa utilizando el etiquetado isotópico más LC-MS.
Abstract
La peptidómica se puede definir como el análisis cualitativo y cuantitativo de péptidos en una muestra biológica. Sus principales aplicaciones incluyen la identificación de los biomarcadores peptídicos de la enfermedad o el estrés ambiental, la identificación de neuropéptidos, hormonas y péptidos intracelulares bioactivos, el descubrimiento de péptidos antimicrobianos y nutracéuticos a partir de hidrolizados de proteínas, y se puede utilizar en estudios para comprender los procesos proteolíticos. El reciente avance en la preparación de muestras, métodos de separación, técnicas de espectrometría de masas y herramientas computacionales relacionadas con la secuenciación de proteínas ha contribuido al aumento del número de péptidos identificados y peptidos caracterizados. Los estudios peptidómicos analizan con frecuencia péptidos que se generan naturalmente en las células. Aquí, se describe un protocolo de preparación de muestras basado en la inactivación por calor, que elimina la actividad de la proteasa, y la extracción con condiciones suaves, por lo que no hay escisión de enlaces peptídicos. Además, también se muestra la cuantificación relativa de péptidos utilizando el etiquetado de isótopos estables por metilación reductiva de aminas. Este método de etiquetado tiene algunas ventajas ya que los reactivos están disponibles comercialmente, son baratos en comparación con otros, químicamente estables y permiten el análisis de hasta cinco muestras en una sola ejecución LC-MS.
Introduction
Las ciencias “ómicas” se caracterizan por el análisis profundo de un conjunto de moléculas, como ADN, ARN, proteínas, péptidos, metabolitos, etc. Estos conjuntos de datos generados a gran escala (genómica, transcriptómica, proteómica, peptidómica, metabolómica, etc.) han revolucionado la biología y han llevado a una comprensión avanzada de los procesos biológicos1. El término peptidómica comenzó a introducirse a principios del siglo 20, y algunos autores se han referido a él como una rama de la proteómica2. Sin embargo, la peptidómica tiene distintas particularidades, donde el interés principal es investigar el contenido de péptidos generados naturalmente durante los procesos celulares, así como la caracterización de la actividad biológica de estas moléculas3,4.
Inicialmente, los estudios de péptidos bioactivos se restringieron a los neuropéptidos y péptidos hormonales a través de la degradación de Edman y el radioinmunoensayo. Sin embargo, estas técnicas no permiten un análisis global, dependiendo del aislamiento de cada péptido en altas concentraciones, tiempo para la generación de anticuerpos, además de la posibilidad de reactividad cruzada5.
El análisis peptidómico solo fue posible después de varios avances en espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida (LC-MS) y proyectos de genoma que entregaron grupos de datos completos para estudios de proteómica / peptidómica6,7. Además, era necesario establecer un protocolo específico de extracción de péptidos para peptidomes porque los primeros estudios que analizaron neuropéptidos a nivel mundial en muestras cerebrales mostraron que la detección se vio afectada por la degradación masiva de proteínas, que ocurren principalmente en este tejido después de 1 min post mortem. La presencia de estos fragmentos peptídicos enmascaró la señal del neuropéptido y no representó el peptidomo in vivo. Este problema se resolvió principalmente con la aplicación de la inactivación por calentamiento rápido de proteasas mediante irradiación por microondas, lo que redujo drásticamente la presencia de estos fragmentos de artefactos y permitió no solo la identificación de fragmentos de neuropéptidos sino que reveló la presencia de un conjunto de péptidos a partir de proteínas citosólicas, mitocondriales y nucleares, diferentes de degradome6,8,9.
Estos procedimientos metodológicos permitieron una expansión del peptídomo más allá de los conocidos neuropéptidos, donde se han identificado cientos de péptidos intracelulares generados principalmente por la acción de proteasomas en levaduras10, pez cebra11, tejidos de roedores12 y células humanas13. Se ha demostrado ampliamente que decenas de estos péptidos intracelulares tienen actividades biológicas y farmacológicas14,15. Además, estos péptidos pueden ser utilizados como biomarcadores de la enfermedad y posiblemente tener importancia clínica, como se demuestra en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con aneurismas sacculares intracraneales16.
Actualmente, además de la identificación de secuencias peptídicas, es posible a través de la espectrometría de masas obtener datos de cuantificación absoluta y relativa. En la cuantificación absoluta, los niveles de péptidos en una muestra biológica se comparan con los estándares sintéticos, mientras que en la cuantificación relativa, los niveles de péptidos se comparan entre dos o más muestras17. La cuantificación relativa se puede realizar utilizando los siguientes enfoques: 1) “libre de etiquetas”18; 2) etiquetado metabólico in vivo o 3) etiquetado químico. Los dos últimos se basan en el uso de formas isotópicas estables incorporadas a péptidos19,20. En el análisis sin etiquetas, los niveles de péptidos se estiman considerando la intensidad de la señal (recuentos espectrales) durante el LC-MS18. Sin embargo, el etiquetado isotópico puede obtener niveles relativos más precisos de péptidos.
Muchos estudios peptidómicos utilizaron reactivos de etiquetado de butirato de trimetilamonio (TMAB) como etiquetado químico, y más recientemente, se ha utilizado la metilación reductiva de aminas (RMA) con formas deuteradas y no deuteradas de formaldehído y reactivos de cianoborohidruro de sodio11,21,22. Sin embargo, las etiquetas TMAB no están disponibles comercialmente, y el proceso de síntesis es muy laborioso. Por otro lado, en el RMA, los reactivos están disponibles comercialmente, son baratos en comparación con otras etiquetas, el procedimiento es simple de realizar y los péptidos etiquetados son estables23,24.
El uso de RMA implica la formación de una base de Schiff al permitir que los péptidos reaccionen con el formaldehído, seguido de una reacción de reducción a través del cianoborohidruro. Esta reacción provoca dimetilación de los grupos amino libres en las cadenas laterales N-terminales y lisina y monometilatos N-terminales prolinas. Como los residuos de prolina son a menudo raros en el N-terminal, prácticamente todos los péptidos con aminas libres en el N-terminal están marcados con dos grupos metilo23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la mayoría de los estudios de peptidómica, uno de los pasos críticos es, sin duda, la preparación de la muestra que debe realizarse cuidadosamente para evitar la presencia de fragmentos peptídicos generados por las proteasas después de unos minutos post mortem. Los estudios iniciales sobre extractos cerebrales preparados a partir de muestras no microondas mostraron un gran número de fragmentos de proteínas presentes en los microfiltratos de 10 kDa. Se han descrito diferentes enfoques para evitar espectros pept…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El desarrollo y uso de las técnicas descritas aquí fueron apoyados por la subvención del Consejo Nacional de Investigación de Brasil 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) becas 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) y 21/01286-1 (MEME). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del artículo.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
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