Provberedning och relativ mängd med reduktiv metylering av aminer för peptidomikstudier
Summary
Denna artikel beskriver en provberedningsmetod baserad på värme-inaktivering för att bevara endogena peptider undvika nedbrytning post-mortem, följt av relativ mängd med isotopisk märkning plus LC-MS.
Abstract
Peptidomik kan definieras som kvalitativ och kvantitativ analys av peptider i ett biologiskt prov. Dess huvudsakliga tillämpningar inkluderar identifiering av peptid biomarkörer för sjukdom eller miljöbelastning, identifiera neuropeptider, hormoner, och bioaktiva intracellulära peptider, upptäcka antimikrobiella och nutraceutical peptider från protein hydrolysat, och kan användas i studier för att förstå de proteolytiska processerna. Den senaste tidens framsteg inom provberedning, separationsmetoder, masspektrometritekniker och beräkningsverktyg relaterade till proteinsekvensering har bidragit till ökningen av det identifierade peptidertalet och peptidomer som karakteriseras. Peptidomiska studier analyserar ofta peptider som genereras naturligt i celler. Här beskrivs ett provberedningsprotokoll baserat på värmeinaktivering, vilket eliminerar proteasaktivitet och extraktion med milda förhållanden, så det finns ingen peptidbindning klyvning. Dessutom visas den relativa kvantiteten av peptider med stabil isotopmärkning genom reduktiv metylering av aminer. Denna märkningsmetod har vissa fördelar eftersom reagenserna är kommersiellt tillgängliga, billiga jämfört med andra, kemiskt stabila och möjliggör analys av upp till fem prover i en enda LC-MS-körning.
Introduction
“Omics” vetenskaper kännetecknas av djup analys av en molekyluppsättning, såsom DNA, RNA, proteiner, peptider, metaboliter etc. Dessa genererade storskaliga datamängder (genomik, transkriptomik, proteomik, peptidomik, metabolomik, etc.) har revolutionerat biologin och lett till en avancerad förståelse av biologiska processer1. Termen peptidomics började introduceras i början av 1900-talet, och vissa författare har hänvisat till det som en gren av proteomik2. Peptidomik har dock distinkta särdrag, där huvudintresset är att undersöka det naturligt genererade peptideinnehållet under cellulära processer, liksom karakteriseringen av biologisk aktivitet hos dessa molekyler3,4.
Ursprungligen begränsades bioaktiva peptidstudier till neuropeptider och hormonpeptider genom Edman-nedbrytning och radioimmunoassay. Dessa tekniker tillåter dock inte en global analys, beroende på isoleringen av varje peptid i höga koncentrationer, tid för generering av antikroppar, förutom korsreaktivitetsmöjlighet5.
Peptidomics analys gjordes endast möjligt efter flera framsteg i flytande kromatografi kopplad masspektrometri (LC-MS) och genomprojekt som levererade omfattande datapooler för proteomik/peptidomik studier6,7. Dessutom behövde ett specifikt peptidextraktionsprotokoll för peptidomer fastställas eftersom de första studierna som analyserade neuropeptider globalt i hjärnprover visade att detektion påverkades av den massiva nedbrytningen av proteiner, som främst förekommer i denna vävnad efter 1 min obduktion. Förekomsten av dessa peptidfragment maskerade neuropeptidsignalen och representerade inte peptidome in vivo. Detta problem löstes främst med tillämpning av snabb uppvärmning inaktivering av proteaser med hjälp av mikrovåg bestrålning, vilket drastiskt minskade förekomsten av dessa artefakt fragment och tillät inte bara identifiering av neuropeptid fragment men avslöjade förekomsten av en uppsättning peptider från cytosoliska, mitokondriella och nukleära proteiner, olika av degradome6,8,9.
Dessa metodologiska förfaranden tillät en utvidgning av peptidom bortom de välkända neuropeptiderna, där hundratals intracellulära peptider som främst genereras av proteasomernas verkan har identifierats i jäst10, zebrafisk11, gnagare vävnader12 och mänskliga celler13. Dussintals av dessa intracellulära peptider har i stor utsträckning visat sig ha både biologiska och farmakologiska aktiviteter14,15. Dessutom kan dessa peptider användas som sjukdomsbiomarkörer och eventuellt ha klinisk betydelse, vilket visats i ryggmärgsvätskan från patienter med intrakraniell saccular aneurysms16.
För närvarande, förutom identifiering av peptidsekvenser, är det möjligt genom masspektrometri att erhålla data om absolut och relativ mängd. I den absoluta kvantiteten jämförs peptidnivåerna i ett biologiskt prov med syntetiska standarder, medan peptidnivåerna jämförs mellan två eller flera prover17 i den relativa kvantiteten. Relativ kvantitet kan utföras med följande metoder: 1) “etikettfri”18; 2) in vivo metabolisk märkning eller 3) kemisk märkning. De två sista är baserade på användningen av stabila isotopformer som ingår i peptider19,20. I etikettfri analys uppskattas peptidnivåerna med hänsyn till signalstyrkan (spektralantal) under LC-MS18. Isotopmärkning kan dock få mer exakta relativa nivåer av peptider.
Många peptidomiska studier använde trimetylammonium butyrat (TMAB) märkning reagenser som kemisk märkning, och på senare tid, Reduktiv metylering av amines (RMA) med deutererade och icke-deutererade former av formaldehyd och natrium cyanoborohydrid reagenser har använts11,21,22. TMAB-etiketterna är dock inte kommersiellt tillgängliga, och syntesprocessen är mycket mödosam. Å andra sidan, i RMA, reagenserna är kommersiellt tillgängliga, billiga jämfört med andra etiketter, förfarandet är enkelt att utföra och de märkta peptiderna är stabila23,24.
Användningen av RMA innebär att bilda en Schiff-bas genom att låta peptiderna reagera med formaldehyd, följt av en reduktionsreaktion genom cyanoborohydrid. Denna reaktion orsakar dimetylering av fria aminogrupper på N-terminaler och lysin sidokedjor och monometylater N-terminal prolines. Hur prolinrester ofta är sällsynta på N-terminalen, praktiskt taget alla peptider med fria aminer på N-ändstationen är märkta med två metylgrupper23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de flesta peptidomikstudier är ett av de kritiska stegen utan tvekan provberedningen som bör utföras noggrant för att undvika förekomst av peptidfragment som genereras av proteaser efter några minuter efter döden. De första studierna på hjärnextrakt som framställts av icke-mikrovågsprover visade att ett stort antal proteinfragment fanns i 10-kDa-mikrofiltraterna. Olika metoder har beskrivits för att undvika peptidspektra från proteinnedbrytning: fokuserad mikrovågsbestrålningsdjuroffer6,8, kryostatdisse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utvecklingen och användningen av de tekniker som beskrivs här stöddes av Brasiliens nationella forskningsråds anslag 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) bidrag 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) och 21/01286-1 (MEME). Finansiärerna hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda artikeln.
Materials
| 10 kDa cut-off filters | Merck Millipore | UFC801024 | Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrane, 10 kDa |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 11213 | |
| analytical column (EASY-Column) | EASY-Column | (SC200) | 10 cm, ID75 µm, 3 µm, C18-A2 |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Fluorescamine | Sigma-Aldrich | F9015 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde-13C, d2, solution | Sigma-Aldrich | 596388 | |
| Formaldehyde-d2 solution | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| Fume hood | Quimis | Q216 | |
| Hydrochloric acid – HCl | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| LoBind-Protein retention tubes | Eppendorf | EP0030108116-100EA | |
| LTQ-Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | LTQ Velos | |
| Microwave oven | Panasonic | NN-ST67HSRU | |
| n Easy-nLC II nanoHPLC | Thermo Fisher Scientific | LC140 | |
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions Inc. | VERSION 8.5 | |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 3002 | tablets |
| precolumn (EASY-Column) | Thermo Fisher Scientific | (SC001) | 2 cm, ID100 µm, 5 µm, C18-A1 |
| Refrigerated centrifuge | Hermle | Z326K | for conical tubes |
| Refrigerated centrifuge | Vision | VS15000CFNII | for microtubes |
| Reversed-phase cleanup columns (Oasis HLB 1 cc Cartridge) | Waters | 186000383 | Oasis HLB 1 cc Cartridge |
| Sodium cyanoborodeuteride – NaBD3CN | Sigma-Aldrich | 190020 | |
| Sodium cyanoborohydride – NaBH3CN | Sigma-Aldrich | 156159 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | NOTE: 0.2 M PB= 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (26.85 mL of Na2HPO3 1M) plus 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 (23.15 mL of NaH2PO3 1M) to 250 ml of water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Sonicator | Qsonica | Q55-110 | |
| Standard peptide | Proteimax | amino acid sequence: LTLRTKL | |
| Triethylammonium buffer – TEAB 1 M | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid – TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultra purified water | Milli-Q | Direct-Q 3UV | |
| Vacuum centrifuge | GeneVac | MiVac DNA concentrator | |
| Water bath | Cientec | 266 | |
| Xcalibur Software | ThermoFisher Scientific | OPTON-30965 |
References
- Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of ‘omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
- Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
- Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. The peptidomics concept. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).
- Dallas, D. C., et al. Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis. Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).
- Chard, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed). FEBS Letters. 238 (1), 223 (1988).
- Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides. Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).
- Baggerman, G., et al. Peptidomics. Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).
- Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues. Peptides. 11, 1191-1197 (1990).
- Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).
- Dasgupta, S., et al. Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome. PLoS One. 11 (9), 0163312 (2016).
- Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain. Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).
- Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).
- Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. Peptidomic analysis of human cell lines. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).
- De Araujo, C. B., et al. Intracellular peptides in cell biology and pharmacology. Biomolecules. 9, 150 (2019).
- Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies. Molecules. 25 (5), 1093 (2020).
- Sakaya, G. R., et al. Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms. Journal of Proteomics. 240 (3), 104188 (2021).
- Fricker, L. Quantitative peptidomics: General considerations. Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).
- Southey, B. R., et al. Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus. Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).
- Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).
- Boonen, K., et al. Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags. Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).
- Gewehr, M. C. F., et al. The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity. Biomolecules. 10 (2), 321 (2020).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines. Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).
- Tashima, A. K., Fricker, L. D. Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).
- Che, F. Y., et al. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).
- Lyons, P. J., Fricker, L. D. Peptidomic approaches to study proteolytic activity. Current Protocols in Protein Science. , 13 (2011).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range. Science. 178 (4063), 871-872 (1972).
- Ma, B., et al. PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).
- Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis. Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).
- Fricker, L. D. Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).
- Ross, , et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
