Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Summary

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Abbildung ganzer Eierstöcke für quantitative und qualitative Analysen mittels Whole-Mount-Immunfärbung, Multiphotonenmikroskopie sowie 3D-Visualisierung und -Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz, die für die Toxikologie, die klinische Diagnostik und genomische Assays der Eierstockfunktion geeignet ist.

Abstract

Die weibliche Fruchtbarkeit und die reproduktive Lebensdauer hängen von der Qualität und Quantität der Eierstock-Eizellreserve ab. Schätzungsweise 80% der weiblichen Keimzellen, die in die meiotische Prophase I eintreten, werden während der fetalen Eizellabnutzung (FOA) und der ersten Woche des postnatalen Lebens eliminiert. Drei Hauptmechanismen regulieren die Anzahl der Eizellen, die während der Entwicklung überleben, und etablieren die Eierstockreserve bei Frauen, die in die Pubertät eintreten. In der ersten Welle des Eizellverlustes werden 30-50% der Eizellen während der frühen FOA eliminiert, ein Phänomen, das auf eine hohe lange eingestreute Kernelement-1 (LINE-1) -Expression zurückzuführen ist. Die zweite Welle des Eizellverlustes ist die Beseitigung von Eizellen mit meiotischen Defekten durch einen meiotischen Qualitätskontrollpunkt. Die dritte Welle des Eizellverlustes tritt perinatal während der primordialen Follikelbildung auf, wenn einige Eizellen keine Follikel bilden. Es bleibt unklar, was jede dieser drei Wellen des Eizellverlustes reguliert und wie sie die Eierstockreserve bei Mäusen oder Menschen formen.

Immunfluoreszenz und 3D-Visualisierung haben einen neuen Weg eröffnet, um die Entwicklung von Eizellen im Kontext des gesamten Eierstocks abzubilden und zu analysieren, anstatt in weniger informativen 2D-Schnitten. Dieser Artikel bietet ein umfassendes Protokoll für die Immunfärbung des gesamten Eierstocks und die optische Reinigung, das Vorbereitungen für die Bildgebung mittels Multiphotonenmikroskopie und 3D-Modellierung mit kommerziell verfügbarer Software liefert. Es zeigt, wie diese Methode verwendet werden kann, um die Dynamik der Eizellabnutzung während der Eierstockentwicklung bei C57BL/6J-Mäusen zu zeigen und den Eizellverlust während der drei Wellen der Eizellelimination zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auf pränatale und frühe postnatale Eierstöcke zur Visualisierung und Quantifizierung von Eizellen sowie auf andere quantitative Ansätze angewendet werden. Wichtig ist, dass das Protokoll strategisch entwickelt wurde, um eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz zu ermöglichen, die die Anforderungen in der Toxikologie, klinischen Diagnostik und genomischen Assays der Eierstockfunktion erfüllen kann.

Introduction

Die meisten weiblichen Säugetiere werden mit einer endlichen Anzahl von meiotisch stillgelegten Eizellen geboren, die in den Urfollikeln gespeichert sind und die Eierstockreserve (OR) ^bilden1,2. Der OP bestimmt die gesamte weibliche reproduktive Lebenserwartung und Gesundheit³. Der OP nimmt normalerweise mit zunehmendem Alter ab und kann bei Exposition gegenüber bestimmten genotoxischen Wirkstoffen (Bestrahlung / Chemotherapie) und Umweltbelastungen (Unterernährung) vorzeitig erschöpft sein, was zu Unfruchtbarkeit führt ^4,5,6. Idiopathische weibliche Unfruchtbarkeit kann oft auf die genetische und physiologische Qualität von Eiern zurückgeführt werden, die sich aus dem OP entwickeln, und bleibt schlecht verstanden ^7,8. Da die weibliche Follikelausstattung weitgehend durch die Geburt vorbestimmt ist, ist es wichtig, die regulatorischen Mechanismen zu verstehen, die an der Einrichtung und Aufrechterhaltung der OP beteiligt sind.

Bei Mäusen beginnt die OP-Bildung mit der Spezifizierung von primordialen Keimzellen (PGCs) um den Embryonaltag (E) 7.5². Die PGCs wandern zu den Genitalrücken, wo sie sich um etwa E10,5⁹ befinden werden. Die folgende ausgedehnte Proliferation tritt bei unvollständiger Zytokinese auf, was zur Bildung von Zysten führt, die später in der Entwicklung abgebaut werden^10,11. Bei ungefähr E12,5 wird das Gonadengeschlecht bestimmt, und die PGC-Proliferation stoppt in den Eierstöcken. Bei Weibchen treten PGCs, jetzt Eizellen, bei etwa E13,5^12,13 in die meiotische Prophase I (MPI) ein. Die Eizellen durchlaufen eine ausgedehnte MPI und eine Verhaftung im Diktate um die Zeit der Geburt. In der ersten Woche nach der Geburt ist jede festsitzende Eizelle von Granulosazellen umgeben und bildet dadurch einen Urfollikel.

Die Anzahl der Urfollikel im OP eines Weibchens hängt davon ab, wie viele Eizellen die Wellen der Eizellelimination überlebt haben, die vor und während des MPI-Stillstands durch Apoptose, Autophagie oder Nekrose auftreten^14,15. Die erste Welle tritt während der fetalen Entwicklung auf und wird als FOA bezeichnet. FOA ist ein evolutionär konservierter Prozess bei Weibchen (Säugetiere und Nicht-Säugetiere), wobei schätzungsweise ^50-80% der Eizellen je nach weiblicher Art^16,17,18,19 eliminiert werden. Bei Mäusen tritt FOA während E15.5 bis E18.5 auf und wurde auf die Reaktivierung und Expression von Retrotransposon-LINE-1-Sequenzen zurückgeführt, die zum Tod der Eizellen^20,21 führten. Die zweite Welle der Eizellelimination erfolgt durch einen meiotischen Checkpoint, der Eizellen mit meiotischen Defekten wie nicht reparierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) ^{eliminiert22,23}. Die nächste Welle der Eizellelimination tritt während des Zystenabbaus auf und gipfelt in der Bildung von Urfollikeln, von denen jede eine einzelne Eizelle 10,11,24,25 enthält.

Bei Mäusen wird die ursprüngliche Follikelreserve weitgehend durch die Pubertät festgelegt, danach nimmt sie ab, da die primordialen Follikel während regelmäßiger Fortpflanzungszyklen für das Wachstum aktiviert werden. Die OP-Größe variiert zwischen einzelnen Frauen und zwischen verschiedenen genetischen Stämmen von Mäusen; Die genetische Regulation der ^OP-Größe ist jedoch nicht gut verstanden^26,27,28,29. Genetische Studien der OP-Regulation werden durch das Fehlen standardisierter Protokolle zur Untersuchung der Wellen der Eizellelimination während der pränatalen und postnatalen Entwicklung behindert. Mehrere Methoden zur Quantifizierung von Eizellen wurden an Mäusen entwickelt, wobei die häufigste und am weitesten verbreitete histomorphometrische Auswertung histomorphometrischer Abschnitte^30,31 ist. Bei dieser Technik werden Eizellen auf seriellen Abschnitten mit histologischen Färbungen wie Hämatoxylin und Eosin (H & E) und periodischer Säure-Schiff (PAS) oder fluoreszierenden Markern identifiziert. Diese Technik ist zuverlässig, wenn alle Bedingungen konstant bleiben, einschließlich der Abschnittsdicke, der effizienten Wiederherstellung aller Abschnitte im gesamten Eierstock und der Zählschemata der einzelnen Laboratorien. Die von verschiedenen Labors gemeldeten Zahlen unterscheiden sich jedoch oft erheblich und sind daher nicht leicht vergleichbar.

Darüber hinaus kann die Verwendung verschiedener Mausstämme angesichts genetischer Unterschiede auch die Anzahl der Eizellen beeinflussen. Weitere Berechnungsansätze wurden für die histomorphometrische Auswertung entwickelt und umfassen die automatisierte Erkennung von Eizellen mit dem Fraktionierungsansatz, die automatische Zählung mit Rechenalgorithmen und die 3D-Rekonstruktion histologischer Bilder, um eine Mehrfachzählung derselben Eizelle^zu verhindern 31,32,33,34,35,36 . Selbst wenn diese Verbesserungen der histomorphometrischen Auswertung hinzugefügt werden, ist die Technik relativ arbeitsintensiv, insbesondere für groß angelegte und Hochdurchsatzstudien. Die gesammelten Daten sind aufgrund von Unterschieden in den Zählschemata, Computeralgorithmen und der verwendeten Software möglicherweise nicht reproduzierbar und zwischen den Studien vergleichbar.

In jüngster Zeit, beschleunigt durch die Entwicklung neuer Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie mit mittlerer Auflösung und optischer Gewebereinigungsmethoden, werden 3D-Modellierungs- und Analysetechniken für intakte Eierstöcke zur Methode der Wahl, um die Anzahl der Eizellen effizient zu quantifizieren und die Proteinlokalisierung und -dynamik^{zu untersuchen 37,38}. Diese 3D-Methoden sind typischerweise vorteilhaft gegenüber histologischen Methoden, da Gewebe und Organe besser erhalten und intakt gehalten werden. Darüber hinaus liefern 3D-Analyse und -Modellierung zusätzliche Einblicke in Funktionen und Wechselwirkungen innerhalb und zwischen Zellnischen oder Substrukturen innerhalb des Organs, die bei der 2D-Analyse übersehen werden können.

Die 3D-Analyse ganzer Organe erfordert die Optimierung von Fixations-, Immunfärbungs- und optischen Clearingprotokollen für einzelne Organe wie Eierstöcke ohne Gewebeverzerrung oder -schädigung. Eine zusätzliche Optimierung der Probenmontage für die Bildgebung ist für die hochauflösende Mikroskopie erforderlich und kann von der verfügbaren Bildgebungsplattform abhängen. Schließlich erzeugt die Bildgebung des gesamten intakten Eierstocks eine große Datenmenge für nachfolgende Rechenanalysen. Daher besteht die Notwendigkeit, standardisierte 3D-Methoden zur Zählung von Eizellen für vergleichende Studien und über Entwicklungsstadien hinweg zu entwickeln.

Dieses Protokoll verwendet Standard-Immunfärbungs- und zuvor berichtete Clearing-Protokolle und konzentriert sich auf einen einfachen, benutzerfreundlichen und Hochdurchsatz-Ansatz 38,39,40,41. Das Protokoll ist optimiert, um eine große Anzahl pränataler und postnataler Eierstöcke bis zum postnatalen Tag 28 (P28) und unterschiedliche Größen von Eierstöcken aus verschiedenen genetischen Hintergründen der Maus zu analysieren. Die Immunfärbungsschritte sind für alle Stadien ähnlich; Die Clearingprotokolle unterscheiden sich jedoch für pubertäre Eierstöcke aufgrund ihrer größeren Größe, ScaleS4(0) und CUBIC für kleine und große Eierstöcke bzw.^40,41. Darüber hinaus wird bei P28-Mäusen vor der Fixierung eine Ganzkörperperfusion durchgeführt, um die Autofluoreszenz von Blutzellen zu verhindern. Auf der Leica DIVE/4Tune-Plattform wurde ein Multiphotonenmikroskop als Alternative zur Lichtblattmikroskopie zur Bilderfassung entwickelt, und für dieses Protokoll wurde die IMARIS 3D-Visualisierungs- und Analysesoftware mit verschiedenen Analysewerkzeugen ausgewählt. Dieses Protokoll ist einfach zu befolgen und weniger praktisch, daher zeitsparend. Darüber hinaus ist die Quantifizierung der Eizellen relativ schnell, abhängig von der Größe des Eierstocks und der Anordnung der Eizellen.

Protocol

Alle verwendeten Mäuse gehörten dem genetischen Stamm C57BL/6J an (siehe Materialtabelle). Dieser Stamm wurde vollständig sequenziert und ist Standard für viele Studien zur Struktur und Funktion der Eierstöcke. Mäuse wurden gemäß den NIH-Richtlinien untergebracht, und die durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Jackson Laboratory genehmigt. Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Zusammensetzungen sind in der Materialtabelle…

Representative Results

Die Immunfärbung und Bildgebung des gesamten Eierstocks ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Eizell- oder Proteinexpression in Eierstöcken in verschiedenen Entwicklungsstadien mit derselben Technik und denselben Markern (Abbildung 3). Dieses Protokoll wurde für ein Großprojekt entwickelt, in dem die Analyse von Eierstöcken in mehreren Stadien und aus mehreren Mausstämmen erforderlich war. Hier präsentieren wir Daten, die für den Stamm C57BL6/J, einen Standardstamm f…

Discussion

Dieser Artikel stellt ein detailliertes 3D-Immunfärbungs- und Bildgebungsprotokoll für pränatale und postnatale Eierstöcke für Hochdurchsatz- und Vergleichsstudien zur Keimzellquantifizierung und Proteinlokalisierung vor. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um die Anzahl der Eizellen in den Eierstöcken (N = 6-12) an sechs Entwicklungszeitpunkten in 10-16 verschiedenen Stämmen zu analysieren, wobei typischerweise 2-4 24-Well-Platten gleichzeitig verarbeitet werden. Diese Methode kann für andere Organe oder zell…

Materials

Benchtop Incubator	Benchmark Scientific	H2200-H	37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Hazardous material
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
FastWells Reagent Barriers	GraceBio	664113	Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors	FST	91460-11
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glycine	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilution 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Image visualization and analysis software
Insight X3	Spectra-Physics	InSight X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX software	Leica	Version 3.5.6	Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller	SPW Industrial	Model: 7553-50	Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors	FST	14010-17	5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)	Sigma-Aldrich	122262
Rabbit anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilution 1:500
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Hazardous material
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	Hazardous material
Sucrose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	shaker for room temperature
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusion Set	MYCO Medical	7001-23	needles for perfusion
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	low-power LED fluorescence lamp