マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡
Summary
ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。
Abstract
女性の生殖能力と生殖寿命は、卵巣卵母細胞予備の質と量に依存します。減数分裂前期Iに入る雌生殖細胞の推定80%は、胎児卵母細胞消耗(FOA)および出生後生の最初の週に排除される。3つの主要なメカニズムは、発達中に生存し、思春期に入る女性の卵巣予備能を確立する卵母細胞の数を調節する。卵母細胞喪失の第1波では、卵母細胞の30〜50%が初期のFOA中に排除され、これは高い長い散在核元素-1(LINE-1)発現に起因する現象である。卵母細胞喪失の第2の波は、減数分裂品質チェックポイントによる減数分裂欠損を有する卵母細胞の排除である。卵母細胞喪失の第3波は、いくつかの卵母細胞が卵胞を形成できないときに、原始卵胞形成中に周産期に起こる。卵母細胞喪失のこれら3つの波のそれぞれを調節するものと、それらがマウスまたはヒトのいずれかの卵巣予備をどのように形成するかは不明のままである。
免疫蛍光と3Dビジュアライゼーションは、あまり情報量の少ない2Dセクションではなく、卵巣全体のコンテキストで卵母細胞の発生を画像化および分析するための新しい道を開きました。この記事では、全卵巣免疫染色および光学的クリアリングのための包括的なプロトコルを提供し、多光子顕微鏡を使用したイメージングおよび市販のソフトウェアを使用した3Dモデリングのための調製物を得る。C57BL/6Jマウスにおける卵巣発生中の卵母細胞消耗のダイナミクスを示し、卵母細胞排除の3つの波の間の卵母細胞喪失を定量化するために、この方法をどのように使用できるかを示す。このプロトコルは、卵母細胞の視覚化および定量化、ならびに他の定量的アプローチのために、出生前および出生後卵巣に適用することができる。重要なことに、このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイにおけるニーズを満たすことができる、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応するために戦略的に開発されました。
Introduction
ほとんどの哺乳類の雌は、卵巣予備(OR)を構成する原始卵胞内に貯蔵された有限数の減数的に停止した卵母細胞で生まれます1,2。ORは、女性の全体的な生殖寿命と健康状態を決定します3.ORは通常、加齢とともにサイズが減少し、特定の遺伝毒性物質(放射線/化学療法)および環境ストレス(栄養失調)への曝露により早期に枯渇し、不妊症につながる可能性がある4,5,6。特発性女性不妊症は、ORから発達する卵の遺伝的および生理学的品質に起因することが多く、あまり理解されていない7,8。雌卵胞の授乳は出生によって大部分があらかじめ決められているため、ORの確立と維持に関与する調節メカニズムを理解することが不可欠です。
マウスにおいて、OR形成は、胚日(E)7.52の周りの始原生殖細胞(PGC)の仕様から始まる。PGCは生殖器の隆起に移動し、そこで約E10.59が常駐します。以下の広範な増殖は、不完全なサイトカイン作用で起こり、その結果、嚢胞の形成が起こり、それは開発の後半で分解される10,11。約E12.5で、性腺の性別が決定され、卵巣におけるPGC増殖が停止する。女性では、PGC(現在は卵母細胞)は、約E13.512,13で減数分裂前期I(MPI)に入る。卵母細胞は、拡張MPIを介して進行し、出生時の周りの指示段階で逮捕する。生後最初の1週間の間に、逮捕された各卵母細胞は顆粒膜細胞に囲まれ、それによって原始卵胞を形成する。
女性のORにおける始原卵胞の数は、アポトーシス、オートファジー、または壊死によるMPI停止の前および最中に起こる卵母細胞排除の波を生き残った卵母細胞の数に依存する14,15。第1波は胎児の発育中に発生し、FOAとして知られています。FOAは、雌(哺乳類および非哺乳類)における進化的に保存されたプロセスであり、それによって、雌種に応じて卵母細胞の推定50〜80%が排除される16、17、18、19。マウスでは、FOAはE15.5からE18.5の間に発生し、レトロトランスポゾンLINE-1配列の再活性化および発現が卵母細胞死を引き起こすことに起因している20,21。卵母細胞除去の第2波は、修復されていないDNA二本鎖切断(DSB)22,23などの減数分裂欠損を有する卵母細胞を排除する減数分裂チェックポイントを介して起こる。卵母細胞排除の次の波は、嚢胞の分解中に起こり、それぞれが単一の卵母細胞10、11、24、25を含む原始卵胞の形成中に最高潮に達する。
マウスでは、始原卵胞予備は思春期までに大部分が確立され、その後、始原卵胞が定期的な生殖サイクル中に成長のために活性化されるにつれて減少する。ORサイズは、個々の女性間およびマウスの異なる遺伝的系統間で異なる。しかし、ORサイズの遺伝的調節はよく理解されていない26,27,28,29。OR調節の遺伝学的研究は、出生前および出生後の発達中の卵母細胞除去の波を研究するための標準化されたプロトコルの欠如によって妨げられている。いくつかの卵母細胞定量化方法論がマウスにおいて開発されており、最も一般的で広く使用されているのは、組織学的切片30、31の組織形態学的評価である。この技術では、卵母細胞は、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)または蛍光マーカーなどの組織学的染色を有する連続切片上で同定される。この技術は、切片の厚さ、卵巣全体のすべての切片の効率的な回収、および個々の実験室の計数スキームを含む、すべての条件が一定であれば信頼性が高い。しかし、異なる研究所によって報告された数字はしばしば大きく異なるため、容易に比較することはできません。
さらに、遺伝的差異を考えると、異なるマウス系統の使用も卵母細胞数に影響を及ぼし得る。組織形態評価のために追加の計算アプローチが開発されており、フラクショメータアプローチを用いた卵母細胞の自動検出、計算アルゴリズムを用いた自動計数、および同じ卵母細胞の複数の計数を防止するための組織学的画像の3D再構成31、32、33、34、35、36が含まれる。.これらの改善が組織形態評価に追加されても、この技術は、特に大規模でハイスループットな研究では、比較的労働集約的である。収集されたデータは、計数スキーム、コンピュータアルゴリズム、および使用されるソフトウェアの違いにより、研究間で再現性および比較できない場合があります。
近年、新しい中分解能多光子および光シート顕微鏡法および光学組織透明化法の開発によって加速され、無傷の卵巣の3Dモデリングおよび解析技術は、卵母細胞数を効率的に定量し、タンパク質の局在およびダイナミクスを研究するための選択方法になりつつある37,38。これらの3D方法は、組織および器官がよりよく保存され、無傷で維持されるため、組織学的方法と比較して典型的に有利である。さらに、3D解析とモデリングは、2D解析では見逃される可能性のある臓器内の細胞ニッチまたは下部構造内および細胞ニッチまたは下部構造間の機能および相互作用に関する追加の洞察を提供します。
臓器全体の3D解析では、組織の歪みや損傷なしに、卵巣などの個々の臓器の固定、免疫染色、および光学的クリアリングプロトコルを最適化する必要があります。高解像度顕微鏡では、イメージングのためのサンプルマウントの追加最適化が必要であり、利用可能なイメージングプラットフォームに依存する場合があります。最後に、無傷の卵巣全体をイメージングすると、その後の計算分析のために大量のデータが生成されます。したがって、比較研究のために、および発生段階にわたって卵母細胞を計数するための標準化された3D方法を開発する必要がある。
このプロトコルは、標準的な免疫染色および以前に報告されたクリアリングプロトコルを使用し、シンプルでユーザーフレンドリーでハイスループットなアプローチに焦点を当てています38,39,40,41。このプロトコルは、出生後28日目(P28)までの多数の出生前および出生後の卵巣、および異なるマウス遺伝的背景からの様々なサイズの卵巣を分析するように最適化されている。免疫染色ステップは、すべてのステージで類似している。しかし、開嚢プロトコルは、そのサイズが大きいため、思春期卵巣では異なり、ScaleS4(0)およびCUBICは、それぞれ40,41の小卵巣および大型卵巣の場合である。さらに、全身灌流は、血球からの自己蛍光を防ぐために、固定前にP28マウスにおいて行われる。画像を取得するためのライトシート顕微鏡の代替として、Leica DIVE/4Tuneプラットフォーム上に多光子顕微鏡が構築され、このプロトコルにはさまざまな分析ツールを備えたIMARISの3D視覚化および分析ソフトウェアが選択されました。このプロトコルは従うのが簡単で、実践的ではないため、時間を節約できます。さらに、卵母細胞の定量化は、卵巣のサイズおよび卵母細胞の配置に依存して、比較的迅速である。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、生殖細胞定量とタンパク質局在化のためのハイスループットおよび比較研究のための出生前および出生後の卵巣の詳細な3D免疫染色およびイメージングプロトコルを紹介します。我々は、卵巣(N=6-12)の卵母細胞数を、2-4個の24ウェルプレートが通常一度に処理される10-16個の異なる株の6つの発生時点で分析するために開発した。この方法は、他の器官または細胞マーカーに適合?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所の助成金(R01 HD093778からE.B-FおよびT32 HD007065からR.B)によって支援されました。放射線実験に協力してくれたザカリー・ブーシェに感謝します。原稿を批判的に読んでくれたメアリー・アン・ヘンデルに感謝します。私たちは、この出版物に記載されている顕微鏡検査作業の専門家の支援に対するジャクソン研究所のSonia Erattupuzhaと顕微鏡コアサービス、および3Dプリントされたアダプタースライドの設計のためのジャクソン研究所の科学機器サービスのJarek Trapszoの貢献に感謝します。
Materials
| Benchtop Incubator | Benchmark Scientific | H2200-H | 37 °C incubator |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | mouse inbred strain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D1435 | Hazardous material |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| FastWells Reagent Barriers | GraceBio | 664113 | Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well) |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Glycine | ThermoFisher Scientific | BP381-500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | Dilution 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS Software | Oxford Instruments | Version 9.7.0 | Image visualization and analysis software |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight X3 Tunable Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| LASX software | Leica | Version 3.5.6 | Image acquisition software |
| Leica DIVE/4TUNE/FALCON | Leica | Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 | Multiphoton Microscope |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| Masterflex Pump Controller | SPW Industrial | Model: 7553-50 | Peristaltic pump for perfusion |
| Mayo Scissors | FST | 14010-17 | 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm | VWR | 48366-249 | |
| Mini BioMixer | Benchmark Scientific | B3D1020 | shaker/nutator for 37 °C incubator |
| Nikon Ergonomic SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | stereomicroscope |
| Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous material |
| PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | Dissolve in Milli-Q water |
| Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Rabbit anti-DDX4/MVH | Abcam | ab27591 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-TRA98/GCNA | Abcam | ab82527 | Dilution 1:500 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Hazardous material |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | Hazardous material |
| Sucrose | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar Orbital Shaker | Bimedis | VXR-S10 | shaker for room temperature |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK Infusion Set | MYCO Medical | 7001-23 | needles for perfusion |
| Urea | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S/N XT640-W-0147 | low-power LED fluorescence lamp |
References
- Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
- Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
- Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
- Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
- Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
- Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
- Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
- Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
- Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
- Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
- Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Biologie du développement. 234 (2), 339-351 (2001).
- Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
- McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Biologie du développement. 187 (1), 107-113 (1997).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
- Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
- Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, 761-776 (1966).
- Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
- Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Biologie du développement. 231 (2), 291-320 (2001).
- Malki, S., vander Heijden, G. W., O’Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
- Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
- Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
- Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
- Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
- Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
- Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
- Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
- Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts–not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
- Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
- Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Génétique. 206 (4), 1823-1828 (2017).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Microscope slide (25×75) with inset for coverslips (22×22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018)
- Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
- Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -. W., Hadjantonakis, A. -. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
- Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).
