전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사
Summary
여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.
Abstract
여성의 생식력과 생식 수명은 난소 난모세포 예비의 질과 양에 달려 있습니다. meiotic prophase I에 들어가는 여성 생식 세포의 약 80 %는 태아 난모세포 감소 (FOA)와 산후 생후 첫 주 동안 제거됩니다. 세 가지 주요 메커니즘은 발달 중에 생존하는 난모세포의 수를 조절하고 사춘기에 들어가는 여성의 난소 예비를 확립합니다. 난모세포 손실의 첫 번째 파동에서, 난모세포의 30-50 %가 초기 FOA 동안 제거되며, 이는 높은 Long interspersed 핵 요소 -1 (LINE-1) 발현에 기인하는 현상입니다. 난모세포 손실의 두 번째 물결은 meiotic 품질 체크 포인트에 의해 meiotic 결함이있는 난모세포를 제거하는 것입니다. 난모세포 손실의 세 번째 파동은 일부 난모세포가 모낭을 형성하지 못할 때 원시적 인 난포 형성 중에 주산기적으로 발생합니다. 난모세포 손실의이 세 가지 파동 각각을 조절하는 것이 무엇인지, 그리고 그들이 쥐 나 인간에서 난소 예비를 어떻게 형성하는지는 분명하지 않습니다.
면역 형광 및 3D 시각화는 덜 유익한 2D 섹션보다는 전체 난소의 맥락에서 난모세포 발달을 이미지화하고 분석 할 수있는 새로운 길을 열었습니다. 이 기사에서는 전체 난소 면역 염색 및 광학 클리어링을위한 포괄적 인 프로토콜을 제공하여 다중 광자 현미경을 사용한 이미징 및 상용 소프트웨어를 사용한 3D 모델링 제제를 제공합니다. 이 방법을 사용하여 C57BL / 6J 마우스에서 난소 발달 중 난모세포 감소의 역학을 보여주고 난모세포 제거의 세 가지 파동 동안 난모세포 손실을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 난모세포 시각화 및 정량화뿐만 아니라 다른 정량적 접근법을 위해 산전 및 산후 산후 난소에 적용될 수 있습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석의 요구를 충족시킬 수 있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용하기 위해 전략적으로 개발되었습니다.
Introduction
대부분의 포유류 암컷은 원시적 난포 내에 저장된 유한한 수의 meiotically arrested 난모세포로 태어나 난소 예비군 (OR)1,2를 구성합니다. OR은 전체 여성의 생식 수명과 건강을 결정합니다3. OR은 일반적으로 노화와 함께 크기가 감소하고 특정 유전 독성제 (방사선 / 화학 요법) 및 환경 스트레스 (영양 실조)에 노출되면 조기에 고갈 될 수 있으며 불임 4,5,6으로 이어질 수 있습니다. 특발성 여성 불임은 종종 OR에서 발생하는 난자의 유전 적 및 생리적 품질에 기인 할 수 있으며 잘 이해되지 않는 상태로 남아 있습니다 7,8. 여성 여포 기부는 출생에 의해 크게 미리 결정되기 때문에 OR 설립 및 유지 보수와 관련된 규제 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다.
마우스에서, OR 형성은 배아일(E) 7.52 주위의 원발생식세포(PGCs)의 사양으로 시작한다. PGC는 생식기 능선으로 이동하여 약 E10.59에 거주합니다. 다음과 같은 광범위한 증식은 불완전한 사이토 카인 (cytokinesis)으로 발생하여 나중에 발달10,11에서 분해 될 낭종의 형성을 초래합니다. 대략 E12.5에서, 생식선 성관계가 결정되고, PGC 증식은 난소에서 정지된다. 암컷에서, 현재 난모세포인 PGCs는 대략 E13.512,13에서 meiotic prophase I (MPI)에 들어간다. 난모세포는 연장 된 MPI를 통해 진행되며 출생 시점 주변의 지시 단계에서 체포됩니다. 출생 후 첫 주 동안, 체포 된 각 난모세포는 과립 세포에 둘러싸여있어 원시적 인 여포를 형성합니다.
여성의 OR에서 원시적 인 여포의 수는 아폽토시스, 자가포식 또는 괴사를 통해 MPI 체포 전과 중에 발생하는 난모세포 제거의 파동에서 얼마나 많은 난모세포가 살아남 았는지에 달려 있습니다14,15. 첫 번째 파동은 태아 발달 중에 발생하며 FOA로 알려져 있습니다. FOA는 암컷 (포유류 및 비 포유류)에서 진화적으로 보존 된 과정으로, 여성 종 16,17,18,19에 따라 난모세포의 약 50-80 %가 제거됩니다. 마우스에서, FOA는 E15.5 내지 E18.5 동안 발생하며, 난모세포 사멸을 야기하는 레트로트랜스포존 LINE-1 서열의 재활성화 및 발현에 기인한다20,21. 난모세포 제거의 두 번째 파동은 복구되지 않은 DNA 이중 가닥 파단 (DSBs)22,23과 같은 meiotic 결함이있는 난모세포를 제거하는 meiotic 체크 포인트를 통해 발생합니다. 난모세포 제거의 다음 파동은 낭종 붕괴 중에 발생하며, 원시적 인 난포가 형성되는 동안 절정에 달하며, 각각은 단일 난모세포10,11,24,25를 포함합니다.
생쥐에서, 원시적 인 여포 예비는 사춘기에 의해 크게 확립되며, 그 후에 원시적 인 여포가 규칙적인 생식주기 동안 성장을 위해 활성화됨에 따라 감소합니다. OR 크기는 개별 여성 및 마우스의 다른 유전 적 균주에 따라 다릅니다. 그러나, OR 크기의 유전적 조절은 잘 이해되지 않는다26,27,28,29. OR 조절에 대한 유전 연구는 산전 및 산후 발달 동안 난모세포 제거의 파동을 연구하기위한 표준화 된 프로토콜의 부족으로 인해 방해받습니다. 몇몇 난모세포 정량화 방법론이 마우스에서 개발되었으며, 가장 보편적이고 널리 사용되는 것은 조직학적 절편30,31의 조직형태학적 평가이다. 이 기술에서, 난모세포는 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 및 주기적 산 쉬프 (PAS) 또는 형광 마커와 같은 조직 학적 얼룩이있는 연속 절편에서 확인됩니다. 이 기술은 단면 두께, 난소 전체의 모든 섹션의 효율적인 회복 및 개별 실험실의 계수 체계를 포함하여 모든 조건이 일정하게 유지되면 신뢰할 수 있습니다. 그러나 다른 실험실에서보고 된 숫자는 종종 크게 다르므로 쉽게 비교할 수 없습니다.
또한, 유전 적 차이를 감안할 때, 다른 마우스 균주의 사용은 또한 난모세포 수에 영향을 줄 수 있습니다. 조직 형태 평가를 위해 추가 전산 접근법이 개발되었으며 분별기 접근법을 사용한 난모세포의 자동 검출, 계산 알고리즘을 사용한 자동 계산 및 동일한 난모세포의 다중 카운트를 방지하기 위한 조직학적 이미지의 3D 재구성 31,32,33,34,35,36 . 이러한 개선이 조직 형태 측정법 평가에 추가되더라도이 기술은 특히 대규모 및 고처리량 연구의 경우 상대적으로 노동 집약적입니다. 수집 된 데이터는 계산 체계, 컴퓨터 알고리즘 및 사용 된 소프트웨어의 차이로 인해 연구 간에 재현 가능하고 비교할 수 없을 수 있습니다.
최근에, 새로운 중간 분해능 다중 광자 및 광 시트 현미경 및 광학 조직 제거 방법의 개발에 의해 가속화되고, 온전한 난소에 대한 3D 모델링 및 분석 기술은 난모세포 수를 효율적으로 정량화하고 단백질 국소화 및 역학을 연구하기 위한 선택의 방법이 되고 있다(37,38). 이러한 3D 방법은 일반적으로 조직 및 장기가 더 잘 보존되고 온전하게 유지되기 때문에 조직학적 방법에 비해 유리합니다. 또한 3D 분석 및 모델링은 2D 분석에서 놓칠 수있는 기관 내의 세포 틈새 또는 하위 구조 내와 세포 간의 기능 및 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공합니다.
전체 장기의 3D 분석에는 조직 왜곡이나 손상 없이 난소와 같은 개별 장기에 대한 고정, 면역 염색 및 광학 클리어링 프로토콜의 최적화가 필요합니다. 이미징을 위한 샘플 마운팅의 추가적인 최적화는 고해상도 현미경 검사에 필요하며 사용 가능한 이미징 플랫폼에 따라 달라질 수 있습니다. 마지막으로, 전체 손상되지 않은 난소의 이미징은 후속 계산 분석을 위해 많은 양의 데이터를 생성합니다. 따라서 비교 연구 및 발달 단계에 걸쳐 난모세포를 계수하기위한 표준화 된 3D 방법을 개발할 필요가 있습니다.
이 프로토콜은 표준 면역 염색 및 이전에 보고된 클리어링 프로토콜을 사용하며, 단순하고 사용자 친화적이며 높은 처리량 접근법 38,39,40,41에 초점을 맞춥니다. 이 프로토콜은 산후 28 일 (P28)까지의 많은 수의 산전 및 산후 난소와 다양한 마우스 유전 적 배경의 다양한 크기의 난소를 분석하도록 최적화되어 있습니다. 면역염색 단계는 모든 단계에 대해 유사하고; 그러나 사춘기 난소의 경우 클리어링 프로토콜이 더 큰 크기 인 ScaleS4 (0) 및 소형 난소의 경우 CUVIC이 각각40,41 개로 인해 다릅니다. 또한, 전신 관류는 혈액 세포로부터의 자기 형광을 방지하기 위해 고정 전에 P28 마우스에서 수행된다. 다중 광자 현미경은 이미지를 얻기 위해 라이트 시트 현미경의 대안으로 라이카 DIVE/4Tune 플랫폼에 구축되었으며, 다양한 분석 도구를 갖춘 IMARIS 3D 시각화 및 분석 소프트웨어가 이 프로토콜을 위해 선택되었습니다. 이 프로토콜은 따르기 쉽고 실습이 적기 때문에 시간을 절약 할 수 있습니다. 또한, 난모세포 정량화는 난소의 크기와 난모세포의 배열에 따라 상대적으로 빠릅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 생식 세포 정량화 및 단백질 국소화에 대한 높은 처리량 및 비교 연구를 위해 산전 및 산후 난소에 대한 상세한 3D 면역 염색 및 이미징 프로토콜을 제시합니다. 우리는 10-16 개의 다른 균주에서 6 개의 발달 시점에서 난소 (N = 6-12)의 난자 수를 분석하기 위해이 프로토콜을 개발했으며, 2-4 개의 24 웰 플레이트는 일반적으로 한 번에 처리됩니다. 이 방법은 다른 기관 또는 세포 마커에 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 보조금 (R01 HD093778에서 E.B-F로, T32 HD007065에서 R.B로)에 의해 지원되었습니다. 방사선 실험에 도움을 주신 Zachary Boucher에게 감사드립니다. 우리는 원고를 비판적으로 읽은 Mary Ann Handel에게 감사드립니다. 우리는 Sonia Erattupuzha와 Jackson Laboratory의 Microscopy Core Service가 본 간행물에 설명 된 현미경 검사에 대한 전문가의 도움과 잭슨 연구소의 과학 기기 서비스 (Scientific Instrument Services)의 Jarek Trapszo가 3D 인쇄 어댑터 슬라이드를 설계한 것에 대해 감사하게 생각합니다.
Materials
| Benchtop Incubator | Benchmark Scientific | H2200-H | 37 °C incubator |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | mouse inbred strain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D1435 | Hazardous material |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| FastWells Reagent Barriers | GraceBio | 664113 | Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well) |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Glycine | ThermoFisher Scientific | BP381-500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | Dilution 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS Software | Oxford Instruments | Version 9.7.0 | Image visualization and analysis software |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight X3 Tunable Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| LASX software | Leica | Version 3.5.6 | Image acquisition software |
| Leica DIVE/4TUNE/FALCON | Leica | Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 | Multiphoton Microscope |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| Masterflex Pump Controller | SPW Industrial | Model: 7553-50 | Peristaltic pump for perfusion |
| Mayo Scissors | FST | 14010-17 | 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm | VWR | 48366-249 | |
| Mini BioMixer | Benchmark Scientific | B3D1020 | shaker/nutator for 37 °C incubator |
| Nikon Ergonomic SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | stereomicroscope |
| Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous material |
| PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | Dissolve in Milli-Q water |
| Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Rabbit anti-DDX4/MVH | Abcam | ab27591 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-TRA98/GCNA | Abcam | ab82527 | Dilution 1:500 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Hazardous material |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | Hazardous material |
| Sucrose | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar Orbital Shaker | Bimedis | VXR-S10 | shaker for room temperature |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK Infusion Set | MYCO Medical | 7001-23 | needles for perfusion |
| Urea | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S/N XT640-W-0147 | low-power LED fluorescence lamp |
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