Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632
Summary
Qui presentiamo un metodo modificato per l’isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali umane aggiungendo l’inibitore della roccia, Y-27632, al metodo tradizionale. Questo metodo è più semplice, richiede meno tempo, migliora le proprietà delle cellule staminali e produce un numero maggiore di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per il laboratorio che per le applicazioni cliniche.
Abstract
Il tessuto gengivale è la prima struttura che protegge i tessuti parodontali e svolge ruoli significativi in molte funzioni orali. L’epitelio gengivale è un’importante struttura del tessuto gengivale, specialmente nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale. Studiare le funzioni delle cellule epiteliali gengivali ha un valore scientifico cruciale, come la riparazione dei difetti orali e la rilevazione della compatibilità dei biomateriali. Poiché le cellule epiteliali gengivali umane sono cellule cheratinizzate altamente differenziate, la loro durata è breve e sono difficili da passare. Finora, ci sono solo due modi per isolare e colturare cellule epiteliali gengivali, un metodo di espianto diretto e un metodo enzimatico. Tuttavia, il tempo necessario per ottenere cellule epiteliali utilizzando il metodo di espianto diretto è più lungo e il tasso di sopravvivenza cellulare del metodo enzimatico è inferiore. Clinicamente, l’acquisizione del tessuto gengivale è limitata, quindi è necessario un sistema di isolamento e coltura in vitro stabile, efficiente e semplice. Abbiamo migliorato il metodo enzimatico tradizionale aggiungendo Y-27632, un inibitore della chinasi rho-associata (ROCK), che può promuovere selettivamente la crescita delle cellule epiteliali. Il nostro metodo enzimatico modificato semplifica le fasi del metodo enzimatico tradizionale e aumenta l’efficienza della coltura delle cellule epiteliali, che presenta vantaggi significativi rispetto al metodo di espianto diretto e al metodo enzimatico.
Introduction
La gengiva umana, la struttura di difesa di prima linea che protegge il tessuto parodontale, non è solo una barriera fisica e chimica1, ma secerne anche diverse classi di mediatori infiammatori che partecipano alle risposte immunitarie e costituiscono una barriera immunitaria2,3. L’epitelio gengivale svolge un ruolo importante nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale. Pertanto, studiare la difesa e l’immunità dell’epitelio gengivale è di grande importanza per comprendere l’insorgenza, la diagnosi e il trattamento della parodontite. L’isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali dal tessuto gengivale umano è il primo passo necessario per studiare l’epitelio gengivale. Tale procedura richiede operazioni di base come la produzione di cellule di semi per l’ingegneria tissutale, modelli in vitro di malattie associate parodontali e materiali per la riparazione di difetti parodontali.
Le cellule epiteliali gengivali primarie sono caratterizzate da un basso tasso di divisione in vitro4, i ricercatori hanno cercato un metodo di isolamento e coltivazione ottimale per decenni. Ad oggi, due diverse tecniche, un metodo di espianto diretto e un metodo enzimatico, sono comunemente utilizzate nei laboratori per ottenere cellule epiteliali gengivali primarie in vitro4,5. Il metodo di espianto diretto presenta vantaggi come la necessità di una minore quantità di campioni di tessuto e una semplice procedura di isolamento, ma presenta gli svantaggi di un tempo di coltura più lungo e della suscettibilità alla contaminazione5. Sebbene il metodo enzimatico ridavi il tempo di coltura richiesto, l’efficienza è relativamente bassa e varia a seconda degli enzimi e del mezzo utilizzato. Kedjarune et al.6 hanno dimostrato che il metodo di espianto diretto, che richiede più tempo prima della sottocoltura (2 settimane), sembra avere più successo per la coltivazione di cellule epiteliali gengivali rispetto al metodo enzimatico. Tuttavia, confrontando questi due metodi, Klingbeil et al.7 hanno scoperto che il metodo enzimatico aveva i migliori risultati per le colture primarie di cellule epiteliali orali ed era possibile ottenere la resa cellulare ottimale nel più breve periodo di tempo (11,9 giorni contro 14,2 giorni).
Pertanto, era importante sviluppare un metodo più conveniente ed efficace per l’isolamento e la coltura delle cellule epiteliali orali4. Abbiamo precedentemente riportato che l’aggiunta di Y-27632, un inibitore della proteina chinasi rho-associata (ROCK), semplifica la procedura di isolamento delle cellule epidermiche primarie umane e dei cheratinociti dai tessuti cutanei adulti8,9,10. Abbiamo sviluppato G-medium, un nuovo mezzo di inoculazione condizionato che separa spontaneamente le cellule epidermiche da quelle dermiche e supporta la crescita e la resa delle cellule epidermiche primarie8,9,10. Nel presente studio, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di isolamento e coltura senza siero per le cellule epiteliali gengivali combinando G-medium con Y-27632. In sostanza, il nostro metodo si basa su una semplificazione del tradizionale metodo enzimatico in due fasi, quindi abbiamo confrontato il nostro nuovo metodo con il metodo dell’espianto diretto. Questo metodo enzimatico modificato riduce significativamente il tempo necessario per separare le cellule epiteliali gengivali dal tessuto gengivale e aumenta l’efficienza della coltura delle cellule epiteliali gengivali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il tessuto gengivale è una struttura chiave che mantiene l’integrità parodontale e la salute. Le cellule epiteliali gengivali hanno ruoli significativi nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale e possono essere utilizzate nella ricerca scientifica e nelle applicazioni cliniche e campi correlati, tra cui biologia orale, farmacologia, tossicologia e carenze della mucosa orale18. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo stabile ed efficiente per raccogliere le cellule epiteliali…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Key Program della Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) e dal Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) a X.W.; il programma chiave di ricerca e sviluppo della provincia di Shandong (2018GSF118240) a J.G.; Progetto di sviluppo medico e sanitario scientifico e tecnologico della provincia di Shandong (2018WS163) a Z.X. e il progetto di sviluppo medico e sanitario scientifico e tecnologico della provincia di Shandong (2019WS045) a J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
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