Isolamento e Cultura das Células Epiteliais Gengivais Humanas Primárias usando Y-27632
Summary
Aqui apresentamos um método modificado para o isolamento e cultura das células epiteliais gengival humanas adicionando o inibidor de Rocha, Y-27632, ao método tradicional. Este método é mais fácil, menos demorado, melhora as propriedades das células-tronco e produz um número maior de células epiteliais de alto potencial, tanto para o laboratório quanto para aplicações clínicas.
Abstract
O tecido gengival é a primeira estrutura que protege os tecidos periodontais e desempenha papéis significativos em muitas funções orais. O epitélio gengival é uma importante estrutura de tecido gengival, especialmente na reparação e regeneração do tecido periodontal. Estudar as funções das células epiteliais gengival tem valor científico crucial, como reparar defeitos orais e detectar a compatibilidade de biomateriais. Como as células epiteliais gengivais humanas são células queratinizadas altamente diferenciadas, sua vida útil é curta, e são difíceis de passar. Até agora, há apenas duas maneiras de isolar e cultivar células epiteliais gengivas, um método de explante direta e um método enzimático. No entanto, o tempo necessário para obter células epiteliais usando o método de explanta direta é maior, e a taxa de sobrevivência celular do método enzimático é menor. Clinicamente, a aquisição de tecido gengival é limitada, por isso é necessário um sistema de isolamento e cultura in vitro estável, eficiente e simples. Melhoramos o método enzimático tradicional adicionando Y-27632, um inibidor de quinase associado a Rho (ROCK), que pode promover seletivamente o crescimento de células epiteliais. Nosso método enzimático modificado simplifica os passos do método enzimático tradicional e aumenta a eficiência da cultura de células epiteliais, que tem vantagens significativas sobre o método de explante direta e o método enzimático.
Introduction
A gingiva humana, a estrutura de defesa de primeira linha que protege o tecido periodontal, não é apenas uma barreira física e química1,mas também secreta diferentes classes de mediadores inflamatórios que participam de respostas imunes e constituem uma barreira imune2,3. O epitélio gengival desempenha um papel importante na reparação e regeneração do tecido periodontal. Portanto, estudar a defesa e imunidade do epitélio gengival é de grande importância para a compreensão da ocorrência, diagnóstico e tratamento da periodontite. O isolamento e a cultura das células epiteliais gengival do tecido gengival humano é o primeiro passo necessário para estudar o epitélio gengival. Tal procedimento requer operações básicas como a produção de células de sementes para a engenharia de tecidos, modelos in vitro de doenças periodontais associadas e materiais para reparação de defeitos periodontais.
As células epiteliais gengivais primárias são caracterizadas por uma baixa taxa de divisão in vitro4, pesquisadores têm procurado um método ideal de isolamento e cultivo há décadas. Até o momento, duas técnicas diferentes, um método de explante direta e um método enzimático, são comumente utilizadas em laboratórios para obter células de epitélio gengival primário in vitro4,5. O método de explante direta tem vantagens como a exigência de uma menor quantidade de amostras de tecido e procedimento de isolamento simples, mas tem as desvantagens de maior tempo de cultura e suscetibilidade à contaminação5. Embora o método enzimático encurte o tempo de cultura necessário, a eficiência é relativamente baixa e varia dependendo das enzimas e médias utilizadas. Kedjarune et al.6 mostraram que o método de explante direta, que requer mais tempo antes da subcultura (2 semanas), parecia ser mais bem sucedido para o cultivo de células epiteliais gengivas em comparação com o método enzimático. No entanto, comparando esses dois métodos, Klingbeil et al.7 descobriram que o método enzimático teve os melhores resultados para as culturas primárias das células epiteliais orais, e foi possível obter o rendimento celular ideal no menor período de tempo (11,9 dias versus 14,2 dias).
Por isso, foi importante desenvolver um método mais conveniente e eficaz para o isolamento e cultura das células epiteliais orais4. Relatamos anteriormente que a adição de Y-27632, um inibidor da quinase proteica associada a Rho (ROCK), simplifica o procedimento de isolamento das células epidérmicas primárias humanas e queratinócitos dos tecidos de pele adultos8,9,10. Desenvolvemos o G-médio, um novo meio de inoculação condicionada que separa espontaneamente epidérmico das células dérmicas e suporta o crescimento e o rendimento das células epidérmicas primárias8,9,10. No presente estudo, desenvolvemos uma nova técnica de isolamento e cultura livre de soro para células epiteliais gengival, combinando G-médio com Y-27632. Em essência, nosso método baseia-se em uma simplificação do método enzimático tradicional de duas etapas, por isso comparamos nosso novo método com o método de explant direto. Este método enzimático modificado encurta significativamente o tempo necessário para separar as células epiteliais gengival do tecido gengival e aumenta a eficiência de cultura de células epiteliais gengivais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O tecido gengival é uma estrutura fundamental que mantém a integridade periodontal e a saúde. As células epiteliais gengival têm papéis significativos na reparação e regeneração do tecido periodontal e podem ser utilizadas em pesquisas científicas e aplicações clínicas e áreas relacionadas, incluindo biologia oral, farmacologia, toxicologia e deficiências de mucosa oral18. Portanto, é necessário desenvolver um método estável e eficiente para a colheita das células epiteliais o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa-Chave da Fundação de Ciência Natural da Província de Shandong (ZR2019ZD36) e pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento da Província de Shandong (2019GSF108107) para X.W.; o Programa de Pesquisa e Desenvolvimento chave da Província de Shandong (2018GSF118240) para J.G.; Projeto de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Médica e Em Saúde da Província de Shandong (2018WS163) para Z.X., e o Projeto de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Médica e Em Saúde da Província de Shandong (2019WS045) para J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
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